第一章:嗜麦芽窄食单胞菌OmpA的细胞粘附性及细胞毒性相关研究目的:探究嗜麦芽窄食单胞菌OmpA对细胞是否具有粘附性及细胞毒性。方法:首先通过IPTG诱导、超声破碎、Ni柱纯化等过程获得重组嗜麦芽窄食单胞菌OmpA（rOmpA）。为了保证研究的可靠性,使用rOmpA免疫新西兰兔获得兔抗rOmpA血清,并利用Western blot法验证rOmpA的同一性。然后,本研究利用Alexa flour 647荧光染料标记rOmpA,并利用流式细胞学方法检测rOmpA对人喉癌上皮细胞（HEp-2细胞,实验室细菌功能性研究常用细胞系）的粘附性。最后利用LDH释放法检测rOmpA对HEp-2细胞毒性,并利用化学发光法及台盼蓝染色法分别检测rOmpA对HEp-2细胞活力及存活率的影响,从而进一步反映出rOmpA的细胞毒性。结果:rOmpA和嗜麦芽窄食单胞菌标准菌株K279a的外膜蛋白（OMPs）均与兔抗rOmpA血清发生特异性免疫反应。Alexa flour 647荧光染料标记后的rOmpA与同等浓度的BSA（阴性对照）分别刺激HEp-2细胞8 h后,被rOmpA刺激的细胞荧光强度明显增高。LDH释放实验检测结果发现rOmpA能够诱导HEp-2细胞释放LDH,细胞培养液上清中LDH的浓度较阴性对照组有明显增加。对HEp-2细胞活力检测结果发现30μg/m L rOmpA组细胞内ATP的含量明显低于阴性对照组,提示细胞活力明显下降,并且在8 h左右活力曲线趋于平行。对HEp-2细胞存活率检测结果发现30μg/m L rOmpA组细胞存活率较阴性对照组有明显地下降,并在8 h左右细胞存活率曲线趋于平行。第二章:嗜麦芽窄食单胞菌OmpA诱导细胞凋亡及炎性反应相关机制细胞实验研究目的:探究嗜麦芽窄食单胞菌OmpA能否诱导细胞凋亡及炎性反应,并阐明其相关机制。方法:研究首先利用流式细胞学技术定量分析rOmpA诱导细胞凋亡情况,并利用DAPI核染色及透射电镜技术观察rOmpA刺激后HEp-2细胞凋亡形态学改变。研究运用线粒体荧光探针标记HEp-2细胞的线粒体,观察rOmpA对HEp-2细胞线粒体膜电位的改变,并运用荧光比色法检测HEp-2细胞线粒体膜通透性转换孔（m PTP）的开放情况。除此之外,研究运用激光共聚焦显微镜来检测HEp-2细胞内TFAR19的核转位情况,从而间接反映线粒体膜通透性的改变。使用Western blot法分析HEp-2细胞内线粒体途径的促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-x L的表达情况。Western blot法还被用于分析HEp-2细胞内死亡受体途径相关凋亡蛋白Fas、Fas L的表达情况。为了探究rOmpA对HEp-2细胞内ROS的产生及钙离子浓度影响,运用DCFH-DA探针和Fluo-3,AM荧光探针分别检测HEp-2细胞内ROS水平及钙离子浓度的改变。考虑到线粒体途径存在Cyt-c和AIF由线粒体进入胞浆,本研究运用Western blot法分别检测HEp-2细胞线粒体及胞浆内Cyt-c和AIF的表达情况。然后,运用Western blot法检测HEp-2内caspase-3、caspase-9的表达和PARP的裂开情况,判断caspase-9/-3通路的激活情况。在此基础之上,运用Ac-DEVD-p NA和Ac-LEHD-p NA探针分别检测HEp-2细胞内caspase-3和caspase-9底物,从而判断caspase-3和caspase-9的活性随时间变化情况。为了判断rOmpA是否通过定位于线粒体诱导细胞凋亡,本研究运用激光共聚焦显微镜技术检测rOmpA在HEp-2细胞内亚细胞定位。研究运用ELISA法检测HEp-2细胞IL-6、IL-8和TNF-α的分泌情况,从而反映rOmpA诱导HEp-2细胞的炎性反应情况。最后,运用直接法ELISA和间接法ELISA分别检测HEp-2细胞内JNK信号蛋白及磷酸化JNK信号蛋白（p-JNK信号蛋白）的表达情况,判断rOmpA诱导细胞炎性反应过程中是否存在JNK信号蛋白的激活。结果:流式细胞学检测结果显示30μg/mL rOmpA能够诱导HEp-2细胞发生凋亡,其中早期凋亡细胞可达10.2%,晚期凋亡细胞达46.3%,较对照组有明显升高。DAPI细胞核染色发现30μg/m L rOmpA能够诱导HEp-2细胞发生核固缩。透射电镜观察到30μg/m L rOmpA刺激8 h后的HEp-2细胞染色质呈帽状附于核膜。流式细胞学检测结果发现30μg/m L rOmpA刺激后的HEp-2线粒体荧光较对照组有明显地降低,提示线粒体膜电位去极化。荧光比色结果显示30μg/m L rOmpA能够诱导m PTP的开放。共聚焦显微镜检测结果发现30μg/m L rOmpA能够诱导HEp-2细胞内TFAR19蛋白发生核转位。Western blot检测结果显示30μg/m L rOmpA能够诱导HEp-2细胞内Bax表达增加,Bcl-x L表达降低,Fas、Fas L的表达与对照组无明显差异。Western blot显示30μg/m L rOmpA能够引起HEp-2细胞线粒体内Cyt-c及AIF的表达降低,而它们在胞浆内的表达增加。荧光检测结果显示30μg/m L rOmpA能够诱导HEp-2细胞内ROS的产生及钙离子浓度升高。Western blot显示30μg/m L rOmpA能够诱导HEp-2细胞内caspase-3、caspase-9的激活及PARP的裂开。Caspase-3和caspase-9的随时间变化曲线显示rOmpA能够引起这两种酶的活性均呈现先升高后降低的变化趋势,并且在8 h时间点达到顶峰。rOmpA亚细胞结构定位实验结果显示标记rOmpA的绿色荧光与标记线粒体的红色荧光发生融合,并呈现黄色荧光,而未与标记细胞核的蓝色荧光发生融合。ELISA检测结果显示,30μg/m L rOmpA能够刺激HEp-2细胞释放IL-6、IL-8和TNF-α的释放。ELISA检测结果同样显示30μg/m L rOmpA能够诱导HEp-2细胞内磷酸化JNK信号蛋白（p-JNK信号蛋白）表达水平的增加。第三章:嗜麦芽窄食单胞菌OmpA诱导细胞凋亡及炎性反应相关研究的动物实验验证。目的:通过动物实验验证OmpA诱导细胞凋亡及炎性反应。方法:建立rOmpA诱导细胞凋亡动物模型,并在此模型基础上使用TUNEL染色检测咽喉组织细胞凋亡情况,从而评价模型是否成功。使用Western blot的方法检测小鼠咽喉组织Bax和Bcl-x L表达情况。使用ELISA法分别检测小鼠口腔灌洗液和支气管肺泡灌洗液中IL-6、IL-8和TNF-α的水平。制作组织病理切片用于小鼠肺组织炎性反应变化的观察。运用ELISA法检测小鼠咽喉组织匀浆中JNK信号蛋白及磷酸化JNK信号蛋白（p-JNK信号蛋白）表达水平。结果:TUNEL染色结果发现300μg rOmpA组凋亡细胞的百分率明显高于PBS阴性对照组。100μg rOmpA组与PBS阴性对照组相比,凋亡细胞的百分率有一定程度地升高,但差异无统计学意义。Western blot结果显示300μg rOmpA能够刺激小鼠咽喉组织Bax表达增加,Bcl-x L表达降低。ELISA检测结果显示300μg rOmpA组小鼠口腔灌洗液中IL-6、IL-8及TNF-α分泌水平与阴性对照组相比,有不同程度地升高,以IL-8及TNF-α较为明显。300μg rOmpA组支气管肺泡灌洗液中IL-6、IL-8及TNF-α的分泌水平与阴性对照组相比,有不同程度地升高,以IL-6及TNF-α较为明显。组织病理切片观察结果显示300μg rOmpA能够刺激小鼠咽喉组织出现巨噬细胞等炎性细胞浸润。ELISA检测结果显示300μg rOmpA组小鼠咽喉组织磷酸化JNK信号蛋白表达水平明显高于阴性对照组。结论:本研究证实了OmpA对细胞具有粘附性。除此之外,OmpA对细胞有细胞毒性,能够引起HEp-2细胞活力及存活率的降低。OmpA能够诱导细胞凋亡,并且出现典型的形态学变化。OmpA在诱导细胞凋亡同时,改变了线粒体膜通透性。对凋亡相关蛋白的表达研究发现OmpA可能通过线粒体途径诱导细胞凋亡,Cyt-c和AIF由线粒体进入胞浆更一步印证了这个结论。胞浆内ROS的产生与钙离子浓度的升高在进一步证实OmpA在诱导细胞线粒体外膜通透性改变结论的同时,侧面反映出这也许是导致细胞凋亡的潜在因素。OmpA诱导HEp-2细胞内caspase-3、caspase-9的激活,这更加证实了细胞凋亡的发生。OmpA的亚细胞定位证实OmpA是通过定位于细胞线粒体发挥生物功能。对炎性细胞因子IL-6、IL-8和TNF-α的检测证实OmpA能够诱导细胞炎性反应。细胞内JNK信号蛋白的磷酸化激活证实OmpA在诱导细胞炎性反应过程中可能起到调控作用,具体机制有待进一步研究。OmpA诱导细胞凋亡小鼠动物模型的建立,实现了对OmpA通过调控Bax和Bcl-x L的表达诱导细胞凋亡结论的动物实验验证。与此同时,对口腔及肺泡灌洗液中炎性细胞因子IL-6、IL-8和TNF-α的检测,实现了对OmpA诱导细胞炎性反应结论的动物实验验证,组织病理切片更加证实了此观点。在小鼠咽喉组织匀浆中检测到JNK信号蛋白的激活,更加证实了OmpA诱导的细胞炎性反应过程中,JNK可能起到重要作用。