猪传染性胃肠炎（Swine Transmissible gastroenteritis, TGE）是由冠状病毒科冠状病毒属中的猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus, TGEV）引起的高度传染性肠道疾病，主要临床症状是呕吐、严重腹泻和脱水，各种年龄及品种的猪对本病均易感，尤其对新生仔猪致死率可达 100％。目前，防治该病的最有效手段是接种疫苗。常规疫苗包括弱毒疫苗和灭活疫苗，但它们在一定程度上存在着排毒、散毒、毒力返祖、免疫效果差等缺陷，故免疫效果不够理想，因此，亟需研制一种高效、安全的基因工程疫苗来从根本上防治 TGE。本研究着眼于乳腺生物反应器生产药用蛋白具有安全、高效、成本低廉的优点，利用 TGEV 保护性抗原编码蛋白 S 基因、β－酪蛋白启动子和表达载体 pEGFP-C1 构建了 TGEV 真核表达质粒即基因疫苗。研究内容如下： 1. 本研究根据 TGEV 抗原编码蛋白 S 基因核酸序列，利用引物设计软件 Primer 5.0设计了 5 条引物，通过 RT-PCR 方法直接从含有 TGEV 的猪肠管组织中分段克隆 2 127 bpS1 片段和 2 450 bp S2 片段，经酶切鉴定后，分别克隆至 pMD－T vector，筛选阳性重组子 pMD-S1 和 pMD-S2，穿刺培养送交测序，核酸序列分析证明与不同毒株相同序列同源性均达 94％以上。S1 3′端和 S2 5′端具有 81 bp 的重叠区，因此以 S1 和 S2 的混合物为模板，TS1 和 TS2 为引物，重组 PCR 扩增出 4 496 bp S 基因全长序列，将其克隆至 pGEM-T easy vector，酶切及 PCR 分析证明 S 基因全长序列克隆成功。 2. 根据表达载体 pEGFP-C1 上的多克隆位点及重组质粒 pG-BBCP 中β－酪蛋白启动子序列，设计合成引物 TS1′和 TA2′，即在引物 TS1 5′端添加限制性内切酶 NheⅠ酶切位点，引物TA2 5′端添加限制性内切酶BamHⅠ酶切位点，利用该对引物从质粒pGEM-S上扩增 S′基因，酶切鉴定 PCR 回收产物，然后将其克隆到 pGEM-T easy vector，酶切鉴定重组质粒 pGEM－S′，NheⅠ和 BamHⅠ酶切 pGEM－S′并定向克隆至质粒 pG-BBCP相应位点， 酶切鉴定重组质粒。SacⅠ和 MluⅠ双酶切重组质粒，回收 BCP－S′，并在T4 DNA 连接酶作用下与 pEGFP-C1 定向连接，酶切及 PCR 鉴定，分析表明 TGEV 乳腺特异性表达质粒（即基因疫苗）构建成功。该载体含有强启动子（人巨细胞病毒 CMV），报告基因（增强型绿色荧光蛋白 EGFP），抗性筛选基因（新霉素基因 neor），β－酪蛋白的启动子（2.2 kb 5′调控成分和 0.6 kb 3′端 polyA 加尾信号）及目的基因 TGEV S 基因。为进一步研究 TGEV 核酸疫苗免疫机制的可行性奠定了坚实的基础。