布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种人畜共患病,给畜牧业的发展和人类的健康带来了很大危害。准确的诊断是有效控制和消灭布鲁氏菌病的前提,但目前常用的布鲁氏菌病血清学诊断方法不能区分是疫苗免疫还是自然感染后引起的血清学反应。研制具有标记性的疫苗或寻找合适的布鲁氏菌诊断性抗原一直是人们的目标,所以具有免疫原性和抗原保护作用的布鲁氏菌外膜蛋白就成了研究的热点。本试验从GenBank中下载编码布鲁氏菌外膜蛋白的基因,用BLAST分析后选取与布鲁氏菌猪、牛、羊这三种生物型基因序列的同源性高又与其他革兰氏阴性细菌没有交叉反应的基因,同时对目的基因编码的蛋白质用TMHMM和ConPredⅡ软件进行信号肽和跨膜结构的分析后,选取没有跨膜结构且全部在膜外的蛋白进行研究。本试验依据以上条件选取了羊布鲁氏菌16M预测的分泌性蛋白质Omp15对其进行初步研究。本试验采用降落PCR方法,以灭活的羊布鲁氏菌16M的基因组为模板,扩增出大约423bp的基因片段,将目的基因片段用限制性内切酶BamH I、EcoR I双酶切后直接与同样双酶切的表达载体pGEX-4T-2连接,将该片段克隆于原核表达载体pGEX-4T-2中,之后将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21。经重组载体的菌液PCR鉴定、重组质粒的双酶切鉴定和测序鉴定:证明成功扩增出了目的基因,并且将其成功重组到了表达载体pGEX-4T-2中。重组菌在0.5mmol/L IPTG条件下诱导后5h目的蛋白质表达量达到了高峰。表达融合蛋白质分子量约为41kDa,以包涵体形式存在。以不同浓度尿素洗涤包涵体,然后用8M尿素溶解,电洗脱方法纯化融合蛋白质。用western-blotting分析重组表达的融合蛋白质Omp15的反应原性,发现该蛋白能与豚鼠的布鲁氏菌阳性血清发生较强烈反应。进而用电洗脱方法纯化了该蛋白质,并将其作为抗原包被,用豚鼠的布鲁氏菌阳性血清为一抗,兔抗豚鼠IgG为二抗,进行ELISA检测,进一步探索获得的蛋白质作为诊断蛋白的可能性。本试验成功构建了pGEX-4T-2/Omp15重组载体,并用豚鼠的布鲁氏菌阳性血清证明了Omp15蛋白的反应原性,虽然我们未能最终用ELISA方法证明该蛋白质作为诊断性抗原的可能性,但该结果为蛋白功能研究和布鲁氏菌诊断性蛋白的筛选奠定了基础。