【摘 要】
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1,3-丙二醇(1,3-PD)是一种重要的化工原料,其微生物生产方法已经引起了广泛的重视。在主要的1,3-PD生产菌之一——克雷伯肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)中,甘油通过两个酶
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1,3-丙二醇(1,3-PD)是一种重要的化工原料,其微生物生产方法已经引起了广泛的重视。在主要的1,3-PD生产菌之一——克雷伯肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)中,甘油通过两个酶转化成1,3-PD,分别是甘油脱水酶(GDHt)和1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)。本文通过克隆K. pneumoniae的PDOR基因dhaT,构建了表达载体pET-28a-dhaT和pET-22b-dhaT,在大肠杆菌(E.coli) BL21(DE3)进行原核表达。对诱导剂、诱导时间、诱导温度、蛋白表达部位和酶活力进行了探索。结果表明,乳糖和PTG均可作为诱导剂使PDOR得到高水平的胞内表达；30℃诱导5h即呈现PDOR活性,20℃诱导14h显示3.7倍的酶活力。为实现甘油到1,3-PD的转化,用两种方法——多顺反子表达载体pET-28a-dhaB1B2B3-dhaT的构建和质粒pET-28a-dhaB1B2B3与pET-22b-dhaT的共存,在(E.coli) BL21(DE3)对GDHt和PDOR进行了共表达。两种方法各酶均显示一定的酶活力。在5L发酵罐初步发酵E.coli BL21(pET-28a-dhaB1B2B3-dhaT),实现了甘油到1,3-PD的转化,最终得到0.95g/L的1,3-PD。鉴于大肠杆菌表达菌株各方面的限制因素,构建了两个新的能在Kpneumoniae复制的表达质粒pPk-dhaT和pPk-dhaB1B2B3-dhaT,在K.pneumoniae对PDOR进行了单独过量表达和与GDHt的过量共表达。酶活分析表明GDHt活性提高了85倍,PDOR活性提高1.2倍。对重组Kpneumoniae在5L罐进行初步发酵,得到67.3g/L的1,3-PD,1.97g/L·h的生产能力和46%的质量转化率。
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