ABCA1调节大鼠肺泡巨噬细胞炎症反应过程机制的研究

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目的筛选有效抑制大鼠肺泡巨噬细胞上ABCA1(ATP-binding cassette transporterA1)表达的小干扰RNA(simall interference RNA,siRNA)序列,并检测转染复合物的细胞毒性。方法设计并合成针对ABCA1的siRNA3条(siRNA1172, siRNA5948,siRNA6072)及1条与ABCA1基因无同源性的带绿色荧光标记的阴性对照siRNA,在HiPerFectTransfection Reagent介导下转染大鼠肺泡巨噬细胞。用RT-PCR方法测定干扰后大鼠肺泡巨噬细胞上ABCA1mRNA表达,流式细胞术方法测定干扰后ABCA1蛋白表达,比较其抑制率,筛选出有效抑制靶基因表达的siRNA。采用MTT法检测转染复合物的细胞毒性。结果①siRNA(50nmol·L-1)和HiPerFect Transfection Reagent(6μL)有较高的转染效率;②与阴性对照组相比,ABCA1siRNA(50nmol·L-1)干扰大鼠肺泡巨噬细胞24h后ABCA1mRNA的相对表达量降低,分别降低:71.97%(siRNA1172),77.96%(siRNA5948),76.73%(siRNA6072)。③与阴性对照组相比,ABCA1siRNA(50nmol·L-1)干扰大鼠肺泡巨噬细胞48h后ABCA1蛋白表达降低,分别降低:65.88%(siRNA1172),63.88%(siRNA5948),62.17%(siRNA6072)。结论①三条siRNA均可有效抑制大鼠肺泡巨噬细胞ABCA1的表达。②转染试剂HiPerFect Transfection Reagent6μl与终浓度为50nmol·L-1 siRNA,为合适的转染比例。目的观察脂多糖(LPS)对大鼠肺泡巨噬细胞ATP结合盒转运体A1(ATP-bindingcassette transporter A1,ABCA1)表达的影响,以及ABCA1对于大鼠肺泡巨噬细胞表面Toll样受体4(Toll-like receptor4,TLR4)的影响,探索在LPS诱发的大鼠肺泡巨噬细胞炎症反应过程中,ABCA1的调节机制。方法分别以不同浓度的LPS(0,0.2,2,20,200μg/L)作用于大鼠肺泡巨噬细胞,24h后采用RT-PCR方法测定大鼠肺泡巨噬细胞ABCA1mRNA表达,流式细胞术方法测定ABCA1蛋白表达。以相同浓度的LPS(20μg/L)作用于大鼠肺泡巨噬细胞,于不同的时间点(0,2,6,12,24h),采用上述方法分别测定ABCA1mRNA和蛋白表达。此外,联合使用20μg/L LPS以及特异性抑制ABCA1表达的siRNA干扰大鼠肺泡巨噬细胞,12h后,采用上述方法分别测定TLR4mRNA和蛋白表达。结果①LPS呈浓度和时间依赖性抑制ABCA1mRNA及蛋白质的表达(P<0.05)。②大鼠肺泡巨噬细胞ABCA1的表达被特异性siRNA抑制后LPS引起的TLR4上调较正常组更为明显(P<0.05)。结论在LPS诱发的大鼠肺泡巨噬细胞炎症反应过程中,ABCA1可能通过影响TLR4的表达参与炎症的调节。
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