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天冬氨酸激酶（Aspartokinase，AK）催化底物L-天冬氨酸和ATP生成天冬氨酰-β-磷酸和ADP，是天冬氨酸族氨基酸生物合成途径中首个关键酶，但其活性受分支途径代谢产物的反馈抑制。本研究在实验室成功克隆北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense) AK基因并实现重组质粒pET-28a-AK在大肠杆菌Escherichia coli (E. coli)中异源表达的基础上，对AK进行饱和定点突变并通过高通量筛选方法获得高活力AK突变株，解除AK在合成天冬氨酸族氨基酸途径中受到的反馈抑制并对突变株进行酶学性质表征，为天冬氨酸族氨基酸基因工程菌的构建奠定基础。1.由blast比对得知，北京棒杆菌AK和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) AK氨基酸序列同源性为99%，推测两者具有相似的调节机制和空间结构。通过多重序列比对，确定北京棒杆菌T361位点和A362位点为保守序列，且与谷氨酸棒杆菌T361位点和A362位点完全对应，此外，利用DS3.5软件发现T361位点与抑制剂赖氨酸之间通过氢键相互连接，A362位点与赖氨酸之间通过水分子形成氢键相互连接，这种极性相互作用使得赖氨酸与AK之间的结合更稳定，增强了赖氨酸对AK的反馈抑制。因此，本文以PDB数据库公布的谷氨酸棒杆菌AK晶体结构3AAW为模板，确定对T361位点和A362位点分别进行饱和定点突变。2.设计饱和定点突变引物，利用PCR技术对突变位点进行定点突变，并通过高通量筛选方法，将AK酶活力明显提高的突变株进行扩大培养验证，经测序共获得3株突变株，它们分别是T361K、T361N、和A362I。利用超声波破碎、非变性镍柱纯化野生型和突变株的AK蛋白，并将他们的纯化产物经SDS-PAGE和Western blot验证，结果显示：AK蛋白分子量为48KDa，证明突变株AK蛋白在大肠杆菌中成功表达。3.对野生型和突变株纯化AK进行酶动力学分析，并以Hill方程V=Vm ax(Sn)/(K n+Sn)进行非线性拟合得到野生型和突变株的AK酶动力学曲线，结果显示，T361K、T361N、A362I的Vmax与野生型Vmax（99.74U/mg）相比，分别提高10.34倍、47.99倍、34.60倍。野生型n值为2.93大于1，说明AK是典型的别构酶且具有正协同效应。T361K、T361N、A362I的n值与野生型相比均减小，说明突变株AK的正协同效应降低，T361N AK和A362I AK更趋向于米氏酶。相比野生型Km值，T361K和A362I的Km值减小，说明T361K AK、A362I AK与底物亲和力增大。4.对T361K、T361N和A362I以及野生型AK进行酶学性质表征。结果显示：T361K最适pH相比野生型最适pH8.0升高为8.5，T361N最适pH降低为7.0。A362I最适pH值不变。T361K最适温度与野生型最适温度26℃相比升高为35℃，T361N最适温度不变，A362I最适温度升高为28℃。T361K和野生型的半衰期同为4h，T361N半衰期延长为7h，A362I半衰期提高到6h。与野生型相比，T361K、T361N对金属离子和有机溶剂显示抗性，尤其是T361K对不同浓度金属离子均显示良好的抗性。A362I对抑制剂Lys、Met、Thr+Met、Lys+Met及Thr+Lys+Met均显示良好的抗性，在试验浓度范围内解除了赖氨酸对AK的反馈抑制，并减弱了苏氨酸和赖氨酸对AK的协同反馈抑制，这对天冬氨酸族氨基酸的过量积累具有重要意义。