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目的:特发性肺纤维化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF)为一种发病原因尚不明晰,发病机制尚未清楚的慢性进行性间质性肺疾病。发病率较高且逐年升高,确诊后病死率高,尚无明确的临床分子标志物(biomarker)引导其机制等原因,导致早期诊断、治疗和预后都面临许多困难。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)作为新兴的生物标志物和药物治疗靶点受到高度关注。在前期的工作中,我们课题组找到了一个新的在IPF中上调的lncRNA-ITPF,发现其依赖Smad2/3信号通路,可促进Ⅱ型肺泡上皮细胞转分化及增强肌成纤维细胞的迁移能力,激活在IPF中上调的邻近蛋白编码基因整合素β样1(integrin β-like 1,ITGBL1)的转录发挥促纤维化的作用。本论文拟进行后续研究,明确lncITPF在肺纤维化中的作用以及发挥作用的机制,提供IPF早期诊断和或治疗的生物标志物。方法:通过体外翻译验证lncITPF是否能表现出翻译活性,Northern印迹和快速扩增互补DNA末端获取全长序列。分别用气管内雾化喷入博莱霉素、TGFβ1诱导建立肺纤维化动物和细胞模型;原代培养鉴定表达lncITPF的细胞类型。构建lncITPF过表达载体并验证其功能。实时无标记细胞功能分析技术(Real Time Cellular Analysis,RTCA)检测了在MRC-5细胞中的增殖以及迁移。质粒、siR-lncITPF转染MRC-5细胞,蛋白质印迹法检测蛋白E-cadherin、Vimentin、α-SMA、Snail的水平。RNA荧光原位杂交和核质分离证明细胞内定位,RNA测序,染色质免疫沉淀(ChIP)-qPCR,CRISPR-Cas9技术和启动子活性分析与宿主基因整合素β样1(ITGBL1)之间的关系。荧光素酶活性和ChIP-qPCR探索smad2/3作为lncITPF基因的转录调节因子的可能性。RNA-蛋白质下拉,液相色谱-质谱(LC-MS)和蛋白质-RNA免疫沉淀来探讨lncITPF的下游机制。最后,sh-lncITPF用于评估lncITPF的治疗效果。结果:体外翻译结果证实lncITPF是一个真正的lncRNA,在进化中具有保守性。Northern印迹和快速扩增互补DNA末端得到了 lncITPF的全长序列。通过建立肺纤维化动物和细胞模型,原代培养鉴定了表达lncITPF的细胞种类。实时无标记细胞功能分析技术(Real Time Cellular Analysis,RTCA)显示过表达lncITPF后的MRC-5细胞增殖和迁移能力增强。质粒、siR-lncITPF转染MRC-5细胞,蛋白质印迹法检测蛋白E-cadherin、Vimentin、α-SMA、Snail的水平分别上升和下降。RNA荧光原位杂交和核质分离证明lncITPF主要位于细胞核中。RNA测序,染色质免疫沉淀(ChIP)-qPCR,CRISPR-Cas9技术和启动子活性分析表明lncITPF的纤维化功能取决于它的宿主基因ITGBL1,但他们没有共享启动子也没有共转录。针对lncITPF的特异性过表达的载体可以明显的影响EMT有关的指标(E-cadherin、SP-C、α-SMA、Snail)表达,促进了肌成纤维细胞的迁移。荧光素酶活性和ChIP-qPCR显示smad2/3与lncITPF启动子和TGF-β1-结合smad2/3是纤维化途径的上游诱导物。此外,RNA-蛋白质下拉,液相色谱-质谱(LC-MS)和蛋白质-RNA免疫沉淀表明lncITPF通过靶向异质核核糖核蛋白L(heterogeneous nuclear ribonucleoproteinL,hnRNP-L),调节ITGBL1启动子中的H3和H4组蛋白乙酰化。最后,sh-lncITPF能够在一定程度上减轻博来霉素小鼠肺组织的结构紊乱和胶原沉积,发挥治疗效果。我们的发现为IPF患者提供了治疗的目标或诊断的生物标志物。结论:lncITPF通过结合hnRNP-L靶向其宿主基因ITGBL1促进特发性肺纤维化的发生发展。