【摘 要】
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臭气,特别是氨气的排放是养殖业污染中亟需解决的重要问题之一。近年来,在饲粮中添加微生态制剂,成为养殖场主要的除臭手段之一。前期实验室的研究已经明确了调控谷氨酸脱氢酶（Glutamate dehydrogenase,GDH）和谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase,GS）的基因gdh A和gln A是动物肠道氨气减排菌株中氨氮去除的关键功能基因。在此基础上,本试验运用基因工程技术,
【基金项目】
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国家自然科学基金课题（31772646）、畜禽养殖废弃物生物降解与资源转化调控机制； 国家“十三五”重点研发计划（2018YFD0500206）； 广东省现代农业产业技术体系创新团队项目；
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臭气,特别是氨气的排放是养殖业污染中亟需解决的重要问题之一。近年来,在饲粮中添加微生态制剂,成为养殖场主要的除臭手段之一。前期实验室的研究已经明确了调控谷氨酸脱氢酶（Glutamate dehydrogenase,GDH）和谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase,GS）的基因gdh A和gln A是动物肠道氨气减排菌株中氨氮去除的关键功能基因。在此基础上,本试验运用基因工程技术,将氨氮去除的关键功能基因gdh A和gln A在真核细胞中异源表达,并通过体外发酵试验验证其除臭效果,为进一步提高微生态制剂在实际生产应用中的除臭效果提供理论依据和数据支撑。本研究分三部分。试验一通过基因工程的手段,将凝结芽胞杆菌中的gln A基因和屎肠球菌中的gdh A基因导入毕赤酵母中构建重组菌,并初步验证在不同初始氨氮浓度下的氨氮去除情况。试验二通过优化诱导表达的条件,进一步提高重组菌表达目的蛋白的活性。试验三采用体外发酵技术,通过氨气产量和各项理化指标明确重组菌对蛋鸡氨气产生的影响。主要结果如下:（1）成功构建gln A重组菌、gdh A重组菌以及双基因重组菌。gln A重组菌中GS的酶比活力为17.23 U/mg,gdh A重组菌中GDH的酶比活力为18.11 U/mg,双基因重组菌中GS和GDH的酶比活力分别为13.14 U/mg和15.23 U/mg。在初始氨氮浓度为0.1 mg/m L时的氨氮去除效果最好,双基因重组菌、gdh A重组菌以及gln A重组菌对氨氮的去除率分别为74.8%、58.2%和44.6%,但随着初始氨氮浓度的增加,氨氮的去除效率越来越低。（2）设置不同的条件对诱导表达进行优化。在单一变量的控制下最终得到诱导表达最佳的摇瓶装液量为10%,最佳的菌液接种量为2%、最佳的甲醇添加量为2%。（3）试验组与CK组相比,原菌组、空载菌组、gdh A重组菌组、gln A重组菌组和双基因重组菌组均可以显著降低蛋鸡盲肠中的氨气产量（P＜0.05）,氨气产量分别降低了37.58%,38.44%,63.95%,65.68%和74.04%。此外,重组菌株还可以显著降低发酵液的p H和铵态氮含量（P＜0.05）,刺激铵态氮向硝态氮转化;发酵液中尿酸和尿素的含量以及脲酶的活性也显著降低（P＜0.05）。综上所述,构建的重组菌株均可以显著降低蛋鸡盲肠氨气的产生（P＜0.05）。发酵液中p H的降低,促进了铵态氮向硝态氮的转化。此外,脲酶活性的降低也抑制尿素的转化,进一步降低了氨气的产生。
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