【摘 要】
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漆酶是一种多铜氧化酶,其底物范围广泛,能有效降解工业染料及多种有机污染物。白腐真菌具有丰富的漆酶基因资源,本研究以实验室保留的高产漆酶一色齿毛菌(编号5.1011)为出发菌株,在明确其胞外粗酶液对一类致癌物黄曲霉毒素B1(AFB1)有降解作用的基础上,进行了漆酶基因异源表达、性质表征及对AFB1降解的研究。主要研究结果如下:一色齿毛菌5.1011漆酶能够有效降解AFB1,在45℃,中性或偏碱性的条
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漆酶是一种多铜氧化酶,其底物范围广泛,能有效降解工业染料及多种有机污染物。白腐真菌具有丰富的漆酶基因资源,本研究以实验室保留的高产漆酶一色齿毛菌(编号5.1011)为出发菌株,在明确其胞外粗酶液对一类致癌物黄曲霉毒素B1(AFB1)有降解作用的基础上,进行了漆酶基因异源表达、性质表征及对AFB1降解的研究。主要研究结果如下:一色齿毛菌5.1011漆酶能够有效降解AFB1,在45℃,中性或偏碱性的条件下,5 U/m L漆酶与5μg/m L AFB1反应36 h,AFB1的降解率在70%以上。将5.1011的lac5漆酶基因在毕赤酵母中实现异源表达,探究4种甲醇每日添加量和9种Cu2+含量对重组菌株X33/p PICZα-C-lac5产漆酶的影响。在1%甲醇每日添加量和0.75 m M Cu2+含量的YP培养基进行发酵时,其产酶量最高可达6.95 U/m L。通过分离及部分纯化后得到重组漆酶LAC5,其表观相对分子质量约为88k Da,比酶活为22.34 U/mg,动力学参数Km及Vmax分别为19.19μM和87.93μM·s-1。以ABTS为底物时,LAC5最适反应p H为3.0,最适反应温度为55℃。LAC5的热稳定好,在40、50、60和70℃下,其t1/2分别为29.54、27.72、7.18和1.36 h。重组漆酶对Cu2+、Mg2+、Ni+和Zn2+的适应性比其他金属离子要强,不管反应体系中这几种金属离子的浓度是1或10 m M,其相对酶活性均能保持在90%左右。而在有机溶剂中,LAC5对丙酮、甘油、乙腈以及正丁醇的耐受性比甲醇、乙醇和异丙醇要好。进一步研究了重组漆酶LAC5对黄曲霉毒素AFB1的降解情况。分别探究p H、温度、底物浓度以及酶浓度对AFB1降解效果的影响。5 U/m L的重组漆酶LAC5对5μg/m L AFB1在p H 7.0及35℃反应36 h后的降解率高达95.0%。降解动力学研究结果表明,5.1011漆酶和重组漆酶LAC5降解AFB1符合二级动力学。另外,通过LC-MS鉴定出AFB1的降解产物,并推测出其可能的降解途径。本课题成功表达出齿毛菌5.1011中的一条漆酶基因lac5,且表达出来的漆酶耐热性很好,对AFB1有良好的降解效果,这为扩大漆酶资源及其应用奠定了良好基础。
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