林麝（Forest musk deer,FMD）是我国一级保护动物,由于其经济价值及保护意义,国内对林麝进行人工圈养。肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是一种主要定值于呼吸道的重要人兽共患病原,该菌可引起林麝的化脓性肺炎,从而影响林麝养殖业的健康发展。此外,抗生素的不合理使用导致肺炎克雷伯菌存在多重耐药性,使其治疗也相当困难。同时为了响应全球减抗、禁抗的号召,迫切需要寻找和开发新型有效的抗菌药物。本研究从四川马尔康某林麝养殖场采集水样、粪便等样品,以动物检疫实验室分离保存的林麝源肺炎克雷伯菌LPKP作为指示菌对样品进行筛选,成功分离到一株裂解性肺炎克雷伯菌噬菌体。本试验进一步对该噬菌体基本生物学特性进行测定以及全基因组测序分析;根据基因组序列分析确定内溶素基因并进行原核表达,比较内溶素在抗菌肽修饰前后的体外抑菌效果;同时对由肺炎克雷伯菌感染的肺炎模型小鼠进行内溶素治疗试验,评价其效果。为今后内溶素在防控多重耐药肺炎克雷伯菌感染的临床应用及研究提供依据。1.林麝源肺炎克雷伯菌噬菌体的分离、基本生物学特性及全基因组序列分析本研究以林麝源肺炎克雷伯菌LPKP作为宿主菌,从四川某林麝养殖场的水样中分离到一株裂解性肺炎克雷伯菌噬菌体vB＿KpnS＿MK54。纯化后通过透射电镜观察,结果表明MK54属于有尾噬菌体目（Caudovirales）,长尾噬菌体科（Siphoviridae）。同时对MK54进行裂解谱及基本生物学特性试验,裂解谱结果表明:该噬菌体具有很强的特异性,只裂解宿主菌LPKP;生物学特性试验表明:MK54表面具有囊膜;在较广泛的温度及pH环境下具有稳定的裂解能力;其最佳感染复数为0.01;且一步生长曲线显示噬菌体MK54的潜伏期为20 min,裂解期在20～60 min,裂解量为60PFU/cell。对MK54的核酸进行鉴定及全基因组测序分析,结果表明该噬菌体的遗传物质为双链DNA,全基因组大小为46 218 bp,G+C含量为48.29%,将噬菌体MK54的全基因组序列上传至NCBI,获得登录号MW119258。全基因注释有80个编码序列（CDS）其中有32个CDS已知蛋白功能,48个CDS为假想蛋白序列。并以主要衣壳蛋白和末端酶大亚基的氨基酸序列构建遗传进化树发现,MK54属于长尾噬菌体科下的未分类亚科。2.内溶素LysG24和LysCA的原核表达及体外活性验证根据蛋白注释结果,确定噬菌体MK54的内溶素基因LysG24,同时将天蚕素残基1-8（KWKLFKKI）与LysG24融合,构建了一种新型内溶素（LysCA）。本研究以p ET-32a作为表达载体,对LysG24和LysCA进行原核表达与纯化,并获得有活性的两种重组内溶素蛋白。对纯化后的LysG24和LysCA进行体外抑菌活性验证及环境耐受检测,内溶素蛋白使用浓度均为100μg/mL,以溶菌酶作为阳性对照,PBS作为阴性对照。裂解谱试验结果显示:内溶素LysG24和LysCA的裂解谱比噬菌体MK54的范围更大,而扩大部分以革兰氏阳性菌为主;体外抑菌试验中平板计数法显示两种内溶素均能在6 h内裂解99%的宿主菌LPKP,平板扩散法显示LysCA的抑菌能力最强;温度及pH耐受试验显示LysG24和LysCA都是偏碱性内溶素,且具有一定的耐高温性。3.内溶素LysG24和LysCA治疗肺炎模型小鼠的病理评价本研究通过滴鼻感染肺炎克雷伯菌LPKP建立小鼠肺炎模型。从临床症状的观察、肺脏病理学分析和细菌载量计数等方面对内溶素LysCA和LysG24治疗肺炎小鼠模型的效果进行评价,同时进行内溶素安全性试验。在攻毒LPKP后持续观察各组小鼠临床症状,结果显示:在攻毒后6 h小鼠开始出现临床症状,其中未治疗组小鼠症状不断加重,在48 h内病死率为33.3%;而治疗组的小鼠在攻毒后6 h滴鼻递送内溶素进行治疗,小鼠的临床症状得到恢复且未出现死亡。观察48 h后解剖各组小鼠,对其肺脏进行病理学分析,结果显示:内溶素治疗组小鼠肺部的病变程度及炎性评分均低于攻毒组,内溶素对肺炎克雷伯菌侵袭肺脏有一定的缓解作用。对各组小鼠肺脏进行细菌载量计数,结果显示:LysCA和LysG24治疗组的细菌浓度对数值相比较于攻毒组分别下降了2个数量级和1.6个数量级。对照组及安全组在试验期间生长良好,无任何临床症状,解剖后肺脏无病变及未分离出肺炎克雷伯菌。综合以上试验结果表明:内溶素LysCA和LysG24对实验室感染肺炎的小鼠有一定治疗效果,可以在体内抑制和裂解目标菌,且对小鼠无临床毒性作用,其中LysCA的治疗效果更佳。综上所述,本研究分离鉴定国内外首株林麝源的肺炎克雷伯菌噬菌体,对其内溶素进行了体内和体外抑菌效果的实验室研究,为噬菌体及内溶素治疗临床动物试验提供借鉴,为利用内溶素防控和治疗肺炎克雷伯菌提供参考。