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研究背景及目的炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一组累及胃肠道的慢性非特异性炎症性疾病，包括克罗恩病(Crohn’s disease，CD)和溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)。IBD的病因和发病机制目前尚不十分清楚，多数研究认为与遗传因素、感染因素、肠道免疫功能异常等相关。UC的病变主要累及直肠和结肠的粘膜层和粘膜下层，主要症状有腹痛、腹泻、脓血便和里急后重等，常反复发作。苦参碱是从中药苦参中分离提取的一种生物碱，大量研究证实其具有抗病毒、抗炎、抗肿瘤、抗肝纤维化、免疫调节等作用。但天然提取的苦参碱药物活性较低。我们的前期实验从苦参碱的众多衍生物中筛选出活性较高的M19，体外实验证实，M19抗炎活性较苦参碱提高了10倍，且M19具有较强的抗慢性肝损伤作用。葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS)是一种由蔗糖合成的硫酸多糖体，有大量研究报道由DSS诱导的小鼠实验性结肠炎模型的病变从肛门侧自下而上可侵及全段结肠，其病理改变及临床表现都较接近人类UC，因而被广泛应用于溃疡性结肠炎的实验研究。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号转导通路是细胞内广泛存在一类丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，是细胞内一类非常重要的信号转导通路。细胞在各种外界因素的刺激下，可通过一系列细胞内信号传导途径使MAPK通路被磷酸化而激活，活化后的MAPK可通过磷酸化作用激活多种转录因子，进而引起相应目的基因表达的增加。MAPK信号转导途径在人体内广泛存在，参与细胞增生、分化、发育、凋亡以及炎症等过程。主要的MAPK信号通路包括：c-Jun氨基末端激酶通路/应激激活蛋白(c-Jun N-terminal kinase，JNK/stress activated proteinkinase，JNK/SAPK)，p38MAPK通路（p38mitogen activated protein，p38MAPK），细胞外信号调节蛋白激酶通路(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)。NF-κB是一种调节多种炎症细胞因子、趋化因子表达的核转录因子，广泛存在于各种组织中，可促进与炎症相关的多种基因的转录，从而参与多种原因引起的组织损伤过程。免疫和炎症反应中大量基因的表达受到NF-κB调节的，NF-κB的持续激活与许多炎症性疾病如类风湿性关节炎、炎症性肠炎等相关。p65是NF-κB的重要亚基，激活的NF-κB主要以p65转位入核调节转录。本次课题的主要目的是探讨苦参碱衍生物M19对实验性结肠炎的防治作用和可能的机制。研究方法1、体内实验：建立Balb/c小鼠DSS诱导的实验性结肠炎模型，将80只健康Balb/c小鼠随机分为8组：正常对照组、PBS对照组、DSS组、SASP（100mg/kg）组、苦参碱（30mg/kg）组和M19（1mg/kg，10mg/kg，30mg/kg）组。正常对照组饮用蒸馏水，其余各组自由饮用2%DSS6天，各治疗组于给予DSS前一天起予相应药物灌胃，每天一次，至实验结束。每天观察记录小鼠体重、稀便、便血情况，以评估疾病活动指数（DAI），处死小鼠后比较各组小鼠结肠长度变化，HE染色观察结肠组织病理变化及评分，PAS染色观察结肠上皮杯状细胞变化，Realtime-PCR法检测结肠组织IL-1β、TNF-α表达情况。2、体外实验：体外培养HT29细胞，分为以下5组：正常对照组、TNF-α（10ng/ml）组和M19（0.1μmol/L，1μmol/L，10μmol/L）组。予M19预刺激4小时，除正常对照组外各组均予10ng/ml TNF-α刺激，TNF-α刺激4小时后提取各组细胞总RNA，Realtime-PCR法检测各组细胞IL-1β、TNF-α表达情况。分组及预刺激方法同上，TNF-α刺激15分钟后提取各组细胞总蛋白，Western-Blotting法检测各组细胞p38、ERK、JNK及p65激活情况，探讨M19可能的作用机制。研究结果1、M19可显著减低小鼠实验性结肠炎疾病活动指数（DAI）。M19组平均结肠长度缩短较模型组显著减轻，较SASP组和苦参碱组亦明显减轻。HE染色显示M19可明显减轻实验性结肠炎中的肠上皮破坏及中性粒细胞浸润，PAS染色显示M19可显著缓解结肠炎上皮中的杯状细胞减少。2、Real-time PCR检测显示苦参碱、SASP、M19均可抑制结肠炎小鼠结肠组织中升高的IL-1β、TNF-α mRNA表达，且M19的抑制作用显著优于苦参碱和SASP。3、体外实验中，经M19预处理的HT-29细胞中IL-1β、TNF-α mRNA表达量较TNF-α刺激组显著减低，其中M19高剂量组炎症因子表达最低。M19可抑制TNF-α刺激HT-29细胞引起的MAPK通路p38、ERK、JNK的磷酸化和p65的磷酸化，这可能是M19抗炎作用的机制。结论1.苦参碱、SASP、M19均可显著减轻小鼠DSS实验性结肠炎的严重程度，M19的治疗作用明显优于苦参碱和SASP，M19的抗实验性结肠炎作用可能与抑制肠道促炎因子IL-1β、TNF-α产生有关。2. M19在体外可抑制TNF-α刺激HT-29细胞引起的促炎因子IL-1β、TNF-α表达增加，其作用机制可能与抑制MAPK通路和NF-κB的激活有关。