拟态弧菌(Vibrio mimicus)是一种常见的病原弧菌,可引起养殖鱼类严重的腹水病,给水产养殖业造成较大经济损失。为了有效防控鱼类腹水病,本实验室前期构建了拟态弧菌双靶向核酸疫苗,并经动物免疫试验证实该疫苗具有良好的肠黏膜免疫增强作用,但其确切分子调控机制尚不清楚,需要深入研究。高通量RNA测序技术是(RNA-seq)目前发展最成熟、应用最广的转录组学研究方法。该技术具有高通量、精确,无论有无物种基因组或基因信息,均能直接对物种进行全面转录组分析,且可检测到低丰度的稀有转录本等优势,也为鱼类黏膜免疫调控机制的研究提供了有效方法。对此,本课题在制备拟态弧菌双靶向核酸疫苗的基础上,以口灌方式免疫草鱼,利用RNA-seq技术对免疫前后草鱼肠组织进行差异转录组学分析,探明关键免疫相关的差异表达基因及其涉及通路,并构建其表达载体。主要研究内容和结果总结如下:1)拟态弧菌双靶向核酸疫苗制备、免疫及样品采集。论文按照本实验室曹际建立的方法制备拟态弧菌双靶向核酸疫苗。首先大量抽提拟态弧菌内靶向核酸疫苗(pcDNA3.1-Iclp-Ovepis),然后制备大肠杆菌冻干菌蜕(DH5α-BG),最后将pcDNA3.1-Iclp-Ovepis装载至DH5α-BG中获得拟态弧菌双靶向核酸疫苗。在此基础上,通过口灌方式对实验草鱼进行2次免疫接种,于免疫后第21 d从免疫组与PBS对照组随机取9尾鱼,采集其中后肠段,并将3尾鱼肠段混合成一份样品,每一实验组共有3个生物学重复。2)免疫前后草鱼肠组织的RNA-seq测序与生物信息学分析。使用TRNzol-A+试剂提取上述各肠组织样品中总RNA,建立cDNA文库,利用BGISEQ-500平台对cDNA文库进行双端测序。测序原始数据过滤后,利用RSEM软件计算基因和转录本的表达水平。以差异表达倍数Fold Change(FC)>2.0、错误发现率<0.001且p<0.05为标准筛选差异表达基因(DEGs),结果共鉴定到5 334个DEGs,其中1 275个上调表达,4 059个下调表达,免疫相关DEGs有1 471个。通过GO、KEGG和STRING数据库对DEGs进行生物信息学分析发现,DEGs涉及17个细胞组件、14种分子功能和27个生物学过程。5 334个DEGs中有3 479个DEGs显著富集到53个KEGG Pathway通路中,其中包含10个免疫相关通路。在免疫相关DEGs的互作网络中TAB1、TAK1、p38MAPK、NF-κB、BCR、CTS、Iclp、Hsp70、MR、V型质子ATP 泵和TGFβR 基因为中枢节点基因。3)差异表达基因的qRT-PCR验证。随机挑取30个免疫相关DEGs进行qRT-PCR验证。在建立各目的基因的熔解曲线、扩增曲线和标准曲线的基础上,以适当稀释的检测样品为起始模板浓度,进行qRT-PCR检测,根据2-ΔΔCt法分析各基因的相对表达量,结果发现各验证差异表达基因的相对表达量在疫苗免疫组与PBS对照组间均有显著性差异,且qRT-PCR结果与转录组测序结果的趋势一致。结果表明本次转录组测序数据准确。4)差异表达基因TAB1的表达载体构建与表达。以疫苗免疫后的肠组织cDNA为模板,设计一对特异性引物PCR扩增gcTAB1基因。将测序正确的gcTAB1基因亚克隆至原核表达质粒pGEX-6p-1,随后转化到BL21(DE3)中进行诱导表达。结果表明原核表达重组质粒pGEX-6p1-gcTAB1构建成功,诱导表达后发现rgcTAB1蛋白主要以包涵体形式表达。综上所述,从免疫前后草鱼肠组织中共鉴定到5 334个DEGs,其中包含1 471个免疫相关DEGs。932个免疫相关DEGs显著富集到吞噬体、抗原加工与递呈、NOD样受体、B细胞受体和MAPK信号通路等10个免疫相关通路。同时,成功构建了关键免疫相关基因TAB1的表达载体。