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背景:根面处理剂/生物改性剂常被用来去除根面玷污层并让根面达到生物相容性,对牙周再生有重要意义。液态浓缩生长因子(Liquid Phase Concentrated Growth Factors,LPCGF)是一种继富血小板血浆(Platelet-Rich Plasma,PRP)、富血小板纤维蛋白(Platelet-Rich Fibrin,PRF)之后创新一代的血小板制品,具有促进组织再生的潜力。但是基于现有数据,LPCGF能否作为根面生物改性剂对病变牙根面上牙周膜干细胞产生影响尚未被阐明。目的:本课题通过体外和体内实验,研究液态浓缩生长因子LPCGF的生物学特性及对牙周病变牙片上细胞粘附、增殖、迁移及分化的影响。方法:1.采用酶消化法分离培养hPDLSCs,倒置显微镜下观察细胞形态;克隆形成率和CCK-8检测法评价增殖能力;通过流式细胞法和细胞免疫组化鉴定细胞来源;成骨、成脂、成软骨诱导检测hPDLSCs多向分化的能力。2.采集人静脉血制备凝胶CGF和LPCGF,观察对比性状;吉姆萨染色、电镜观察LPCGF结构;在培养皿中LPCGF与hPDLSCs共培养,分析不同浓度LPCGF刺激下的hPDLSCs细胞骨架和细胞粘附,细胞增殖,细胞水平与垂直迁移,细胞分化的影响。3.收集因牙周病拔除的离体牙,用gracey刮治器行根面刮治及平整后,制备牙块,分组处理:I:对照组(PBS冲洗组);II:19%EDTA组;III:19%EDTA+20%LPCGF联合应用组;IV:20%LPCGF组;测量不同处理组牙块表面粗糙度和亲水性;hPDLSCs接种培养在上述牙块上,CCK-8试剂盒分析不同处理组的hPDLSCs细胞粘附、细胞增殖水平;Transwell模型分析细胞向预先处理的牙块的垂直迁移力;RT-PCR检测牙块上细胞的成骨相关基因(COL-1、ALP、BMP-2);最后用扫描电镜观察分析不同处理组的牙块(有接种细胞和没有接种细胞)。4.将以上4组体外共培养后的细胞-牙块复合体,异位移植于裸鼠皮下,术后8周取材,进行常规的固定、脱钙、包埋、切片操作。HE、Masson染色观察牙块周围牙周支持组织形成的情况;通过免疫组织化学法检测牙I型胶原(COL-1)及骨形成蛋白(BMP-2)表达的情况。结果:1.hPDLSCs原代培养均呈克隆样生长,形态多为短梭形,体积稍小,胞体丰满;克隆形成能力实验显示:hPDLSCs的克隆形成率8.5%;hPDLSCs的增殖曲线,符合细胞对数生长曲线,呈现明显的“S”形;细胞免疫组化显示,细胞均表达波形丝蛋白,不表达角蛋白;同时,流式细胞检测CD146、CD105、CD90阳性表达,而CD35和CD45阴性表达;hPDLSCs均有多向分化的潜力。2.观察LPCGF其呈现黄色,透亮或略浑浊样。它初始状态是流动性,在室温或更高温度时,LPCGF逐渐凝固膜状,絮状;吉姆萨染色和扫描电镜可以观察到镜下LPCGF由厚或薄的纤维网状组成,血细胞如红细胞,血小板,白细胞被包绕其中;粘附实验表明0%LPCGF的对照组的细胞粘附水平明显低于另外5个实验组(P<0.01),而5个实验组(20%、40%、60%、80%、100%浓度)之间区别无统计学意义;增殖实验结果:在第3,5,7天,0%LPCGF的对照组细胞增殖水平均低于其他实验组(p<0.05)。到了第7天,20%浓度组相比其他4个实验组(40%、60%、80%、100%浓度)细胞增殖水平最显著(p<0.01),并呈现“更高浓度,增殖能力更低”的趋势;以20%为最佳LPCGF浓度进行接下来的实验,鬼笔环肽染色观察,细胞的形态无明显差别;细胞划痕实验:所有时间点(12、24和36 h)观测到20%LPCGF组细胞水平迁移速度快于0%LPCGF组(P<0.05);Transwell垂直迁移实验:24 h和48 h两个观测点,实验组(20%LPCGF)细胞均比对照组(0%LPCGF)细胞迁移数目更多(p<0.05);免疫荧光观察,实验组(20%LPCGF)的成骨相关蛋白(COL-1,BMP-2,OPN)表达多于对照组(0%LPCGF)(P<0.05);茜素红染色定量分析,20%LPCGF的实验组矿化沉积优于对照组(p<0.05),和碱性磷酸酶染色结果相似。3.四种不同处理的牙块的表面性状,(EDTA+LPCGF联合)组和(LPCGF单独)组的粗糙度高于对照组和(EDTA单独)组(p<0.05);而亲水性实验,(EDTA单独)组的亲水性则高于其余三组(p<0.05);电镜观察牙块的表面,相比于对照组,(EDTA单独)组表面玷污层被去除,牙本质小孔暴露,而(EDTA+LPCGF)应用组和(LPCGF单独)组的牙块表面被网状纤维蛋白覆盖,其中(EDTA+LPCGF联合)组网状纤维蛋白结够较均匀完整;细胞在不同组牙块上粘附实验:各实验组牙块粘附细胞的数量明显高于对照组(p<0.05),而实验组之间差异无统计学意义;增殖实验:各时间点的实验组牙块的细胞增殖水平均明显高于对照组(p<0.05),而实验组中,(EDTA+LPCGF联合)组在第5,7天细胞增殖水平最高(p<0.05),与电镜观察基本一致;Transwell模型迁移实验:观察到各时间点的实验组牙块的细胞迁移水平均明显高于对照组(p<0.05),在48 h,(EDTA+LPCGF联合)组迁移细胞量大于(EDTA单独)组和(LPCGF单独)组(p<0.05);此外,RT-PCR实验结果表明(EDTA+LPCGF联合)组成骨相关基因表达的显著高于对照组和(EDTA单独)组(p<0.05)。4.通过裸鼠异位移植8周,组织学观察到所有组均能够形成类似牙周韧带样结构。特别是(EDTA+LPCGF)联合应用组的牙块表面周围生成更多的牙周膜纤维样组织,并且牙周膜样纤维排列整齐与牙面贴合紧密。免疫组化染色证明以上观察到的组织非小鼠来源。结论:在本课题有限的研究结果中,本课题发现LPCGF是一种可塑性较好、对细胞有促进作用的天然生物活性材料,并且(EDTA和LPCGF)联合应用于牙根上可以形成一个对牙周膜细胞粘附、增殖、迁移和成骨分化有利的表面。因此,作为新型根面处理剂/根面生物改性的LPCGF可能具有促进牙周再生的潜质,尚需要进一步的研究来支持这些结果。