脊髓损伤往往会导致患者的终生残疾,给患者、家庭和社会带来痛苦和负担,目前临床上仍没有良好的治疗方法,所以对脊髓损伤的病理机制和治疗方法是研究的难点和重点。脊髓损伤的病理过程包括原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤对细胞和组织造成机械性损伤,并向周围组织渗出各种有害因子,具有细胞毒性作用,引发继发性损伤,并沿着脊髓纵轴向头尾两端扩展,形成数倍于原发性损伤的坏死区。所以继发性损伤的形成机制、病理变化以及减轻继发性损伤的方法成为极其重要的研究课题。脊髓损伤过程中,缺血是重要的病理机制,因为血流量的降低会加重脊髓的损伤。为了研究脊髓继发性损伤中的缺血问题,有效显示血管并结合免疫组织化学研究的血管显影方法是必要的研究手段。目前常用的血管显影方法有墨汁灌注法,免疫组织化学方法,单宁酸媒染法,酶组织化学法等等,但这些方法各有弊端,如不能与免疫组织化学研究相结合,过程繁琐或荧光易淬灭等。本实验采用伊文氏蓝进行血管显影,伊文氏蓝是一种荧光染料,在白光下呈蓝色,在荧光显微镜绿色激发光下呈鲜红色,用于研究血脑屏障通透性的改变。它可与血浆白蛋白结合形成伊文氏蓝-白蛋白复合体,再与血管内皮细胞膜上的血浆白蛋白受体结合,因此理论上应该可以通过灌注方法显示血管形态。本实验分为两部分。第一部分为伊文氏蓝血管显影方法的建立。实验动物为C57BL/6小鼠和SD(Sprague-Dawley)大鼠。其中C57BL/6小鼠12只,分为空白对照组,正常灌注固定组。正常灌注固定组小鼠经股静脉注射伊文氏蓝后(空白对照组注射生理盐水),灌注生理盐水和多聚甲醛,冰冻切片三套,一套直接100%酒精脱水透明,中性树胶封片,一套HE染色,一套免疫组化检测GFAP。SD大鼠15只,分为正常组伊文氏蓝灌注后固定组和正常组伊文氏蓝灌注前固定组。其中灌注后固定组又分为空白对照组,正常灌注固定组,显影过程类似于小鼠。灌注前固定组又分为5%明胶伊文氏蓝组,明胶-铬明矾-伊文氏蓝-白蛋白组(简称明-铬-蓝组),对正常大鼠灌注生理盐水和多聚甲醛后,分别注射配制的两种造影溶液,待明胶凝固后进行取材,冰冻切片后直接100%酒精脱水透明,中性树胶封片,或进行免疫组织化学研究。结果表明,正常C57BL/6小鼠注射5%伊文氏蓝0.5ml时,能够清晰地观察到脊髓内的血管。SD大鼠正常组伊文氏蓝灌注后固定组中注射8%伊文氏蓝5ml时,能够清晰地观察到脊髓内血管的形态分布;正常组伊文氏蓝灌注前固定组中,SD大鼠灌注后注射5%明胶伊文氏蓝溶液时血管填充充分,轮廓清晰,而明-铬-蓝组可以显示血管的同时进行免疫组织化学复染。第二部分将建立的血管显影方法用于脊髓损伤的研究。实验动物为SD大鼠,损伤2周后分别采用大鼠灌注后固定组和灌注前固定组方法进行血管显影,冰冻切片并进行免疫组织化学研究。结果显示,灌注后固定组可观察损伤区与正常组织交界部位的血管结构以及血-脊髓屏障破坏情况,相邻切片可进行免疫组织化学研究。灌注前固定组中显影液为5%明胶伊文氏蓝时,血管形态清晰,邻近损伤区伊文氏蓝弥散很少,而显影液为GCEA灌注液时,能够显示血管并进行免疫组织化学复染,但血管形态不如给5%明胶伊文氏蓝清晰。综上所述,本实验系统研究了伊文氏蓝血管显影方法,证明伊文氏蓝是一种很灵敏的标记脊髓血管的荧光染料。不同固定方法及不同的添加剂可产生不同的互补的标记效果。有的方法可进行免疫组化复染,这对脊髓损伤的研究尤为重要。在研究脊髓损伤时可根据研究需要采用某一种方法或组合方法。