成纤维细胞生长因子受体2启动子荧光素酶报告基因重组质粒的构建

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牙槽骨缺损是颌面骨缺损中最为常见的一种,也是义齿修复过程中存在的问题之一。引起牙槽骨缺损的原因有很多,如先天性发育异常(如唇腭裂等)、牙周病、外伤、肿瘤等病理性原因和激素水平改变等生理性原因。牙槽骨的丧失,大范围骨萎缩会降低颌骨的稳定性及功能、累及容貌美观等,严重影响病人的身心健康。牙列缺失患者,牙槽骨缺损使全口义齿无法获得良好的固位;牙列缺损患者,缺牙区牙槽骨重度吸收使固定义齿修复无法达到美观;牙种植患者,必须具有一定高度和宽度的健康牙槽骨才符合手术的适应症;牙周病患者,牙槽骨缺损造成周围支持组织不足,最终导致牙齿脱落。因此,促进牙槽骨缺损修复在口腔医学领域具有深远的理论意义和广泛的临床应用价值。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是一种作用广泛的细胞因子。大量研究证明,bFGF可通过促进新生血管形成、刺激骨及软骨细胞的增殖分化及调节其他生长因子的功能等多种途径来促进牙槽骨的再生。成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptors,FGFRs)为bFGF的受体,是其发挥各种生物学作用的基础。其中,成纤维细胞生长因子受体-2(fibroblast growth factor receptor2,FGFR2)是bFGF的高亲和力受体之一,在促进成骨细胞增殖和分化过程中起重要作用。目的:本项目选择调控牙槽骨修复再生的关键基因--成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)作为靶向,以FGFR2启动子为靶点,构建FGFR2启动子荧光素酶报告基因的重组质粒,以为进一步筛选促进牙槽骨修复再生的药物研究提供基础,指导临床牙槽骨再生的药物治疗,具有重要的理论意义和实际应用价值。方法:通过NCBI数据库查找FGFR2启动子序列,应用primer5.0引物设计软件设计FGFR2启动子的引物,以人类基因组为模板进行PCR。得到的片段与pGEM-T Easy载体连接,将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性质粒进行培养、提取、酶切鉴定及测序。然后,将pGEMT-FGFR2p重组质粒和pGL-2载体进行双酶切后连接,同样进行转化、培养和提取,并行酶切鉴定,成功构建pGL2-FGFR2p重组质粒。结果:通过PCR方法扩增出人类FGFR2启动子序列,测序比对后发现仅有一个位点突变,考虑为点突变或者作为模板的基因组该位点本身突变,成功构建pGL2-FGFR2p重组质粒。结论:1.成功克隆出人类FGFR2启动子序列;2.成功构建pGL2-FGFR2启动子荧光素酶报告基因重组质粒。为临床促进牙槽骨缺损修复再生治疗提供分子靶点,并为指导临床合理用药及后续药物筛选研究奠定了基础。
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