研究背景:在严重烧伤、创伤出血性休克、高原急性缺氧或其他缺氧疾病中,心脏都是损伤的重要靶器官。作为机体的循环动力器官,心肌缺氧损伤会进一步诱发机体供氧减少,加重全身其他组织和器官的损伤。因此,探讨缺氧下心肌细胞的损伤机制对缺氧性心血管疾病的防治具有重要的临床意义。自噬（Autophagy）是广泛存在于真核细胞中进化保守的一种防御与应激调控机制。自噬通过降解长寿命与老化/受损蛋白质促进细胞器的更新和维持细胞稳态,参与了机体生长发育及各种疾病发生发展过程。自噬是一个动态的过程,具体来说包括诱导、囊泡的核化、自噬体成熟、自噬体与溶酶体融合、底物降解与营养再循环,上述步骤的动态过程称为自噬流（Autophagy flux）,大量的研究表明细胞自噬与心肌缺氧、心肌感染、心力衰竭等多种心血管疾病密切相关,在缺氧状态心肌细胞中,细胞自噬体与溶酶体融合受阻,自噬流受损,导致自噬体蓄积,丧失清除受损细胞器的功能,进而加重氧化应激损伤,ROS聚集,线粒体通透性增加,最终导致细胞死亡。但其确切机制尚不明确。许多信号通路和细胞因子参与细胞自噬,瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）是一种广泛分布于细胞膜和细胞器膜上的非选择性阳离子通道,能被各种外源性和内源性的物理或化学刺激激活。研究发现在缺氧心脏中TRPV1通道表达增加,发挥正性肌力和正性变时作用,从而保护缺氧心肌细胞。同时,近期也有研究报道,辣椒素（CPS）激活TRPV1通道可以诱导小鼠胸腺细胞和人肝脏细胞自噬并促进胸腺和肝脏的存活。大部分TRP超家族通道包括TRPV1通道,在胞质膜上,如溶酶体膜上分布广泛,通过Ca²⁺信号参与调控溶酶体的功能和维持溶酶体稳态。腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）是调节生物能量代谢的关键分子,与细胞自噬密切相关,可以被LKB1激酶和Ca²⁺/钙调蛋白依赖的蛋白激酶激酶-β两种途径激活。TRPV1作为非选择性阳离子通道,对Ca²⁺、H⁺等离子具有良好的通透性。而TRPV1是否通过促进Ca²⁺激活溶酶体功能,激活AMPK信号通路从而影响缺氧心肌细胞自噬尚鲜有报道。综上,本研究提出缺氧心肌细胞中自噬体累积,自噬流受损是缺氧心肌细胞损伤的重要原因,CPS激活TRPV1通道可以增强溶酶体活性,改善心肌细胞自噬流,减轻心肌细胞损伤,TRPV1可能通过促进心肌细胞Ca²⁺内流,激活AMPK信号通路来影响心肌细胞自噬的研究假设。旨在探讨TRPV1对缺氧心肌细胞自噬的潜在作用及机制,以期为防治心肌缺氧损伤提供新的理论依据。研究方法:1.以C57BL/6乳鼠原代心肌细胞作为实验对象,体外模拟缺氧环境,建立心肌细胞缺氧模型,蛋白质印迹法（WB法）检测不同缺氧时间（0 h、3 h、6 h、9 h）下心肌细胞的自噬标志蛋白（LC3、Beclin-1、Atg5）的表达变化,观察缺氧心肌细胞中自噬标志蛋白的表达。氯喹阻断缺氧心肌细胞自噬流后,细胞计数试剂盒8（CCK8）和乳酸脱氢酶（LDH）释放法观察心肌细胞活力变化。2.WB法和免疫荧光法（IF法）检测缺氧下TRPV1通道在原代小鼠心肌细胞中的表达;采用CPS激活TRPV1通道的表达,TRPV1 siRNA抑制TRPV1通道的表达,WB法检测TRPV1对心肌细胞的自噬标志蛋白（LC3、Beclin-1、Atg5）的表达变化。CCK8法和LDH释放法检测调控TRPV1后心肌细胞活力。3.按方法2调控TRPV1通道的表达,WB法和IF法检测LAMP-1蛋白的表达及LAMP-1蛋白与LC3蛋白的共定位表达,探讨TRPV1在增强溶酶体活性,促进心肌细胞自噬小体与溶酶体融合中的作用。4.通过WB法检测不同缺氧时间（0 h、3 h、6 h、9 h）下AMPK蛋白的表达,观察缺氧对原代小鼠心肌细胞AMPK蛋白的影响;其次,调控TRPV1后检测原代小鼠心肌细胞中AMPK蛋白的活性变化,观察TRPV1对AMPK蛋白活性的影响;再次,采用A-179662（AMPK激动剂）、Compound C（AMPK抑制剂）调控AMPK蛋白的表达,检测心肌细胞自噬标志蛋白及LAMP-1蛋白的表达,探讨AMPK对缺氧心肌细胞自噬的影响;接下来,CPS激活TRPV1蛋白表达的同时Compound C抑制AMPK蛋白的活性,检测心肌细胞自噬标志蛋白及LAMP-1蛋白的表达。最后,IF法检测CPS激活TRPV1后心肌细胞内Ca²⁺流的变化情况,探讨TRPV1是否通过AMPK蛋白来影响心肌细胞的自噬水平。研究结果:1.缺氧心肌细胞中LC3 II/LC3 I比值、Beclin-1、Atg5蛋白表达增多,自噬体蓄积,氯喹使缺氧心肌细胞自噬流受损,细胞活力进一步下降。2.缺氧心肌细胞中TRPV1表达增加,CPS上调TRPV1通道的表达后,缺氧心肌细胞中LC3 II/LC3 I比值、Beclin-1、Atg5蛋白表达进一步增多,而缺氧心肌细胞活力得到改善;TRPV1 siRNA抑制TRPV1通道表达后,心肌细胞自噬蛋白标志物表达受到抑制,细胞活力无明显改善。3.CPS上调TRPV1通道表达后,缺氧心肌细胞中LAMP-1蛋白表达增多,LAMP-1蛋白与LC3蛋白共定位明显增多;而在TRPV1 siRNA抑制TRPV1通道表达后,上述指标蛋白及共定位水平明显减弱。这些数据表明,激活TRPV1蛋白可以增强缺氧心肌细胞溶酶体活性,促进心肌细胞自噬体与溶酶体融合,促进自噬-溶酶体通路,改善缺氧心肌细胞自噬流。4.WB法显示在缺氧后心肌细胞中p-AMPK蛋白表达增多,AMPK活性增强,CPS和TRPV1 siRNA能分别促进和抑制p-AMPK蛋白的表达。A-179662、Compound C能分别上调和下调心肌细胞p-AMPK的表达。上调p-AMPK蛋白表达后,缺氧心肌细胞中LC3 II/LC3 I比值、Beclin-1、Atg5、LAMP-1蛋白表达明显增多,下调p-AMPK蛋白表达后,上述指标蛋白表达水平明显减弱。CPS与Compound C共同作用下,Compound C有效的抑制了CPS激活的缺氧心肌细胞自噬标志蛋白及LAMP-1蛋白的高表达。在CPS的作用下,缺氧组中细胞内Ca²⁺升高的时间和峰值均高于常氧组。研究结论:本研究初步验证了在缺氧心肌细胞中,自噬体累积、自噬流受损,导致心肌细胞损害;CPS激活TRPV1能够有效增强溶酶体活性,激活缺氧心肌自噬-溶酶体通路,改善缺氧心肌细胞自噬流。减轻缺氧心肌细胞损伤。此外,TRPV1可能通过促进心肌细胞Ca²⁺内流,促进AMPK蛋白磷酸化,激活AMPK细胞信号通路,从而促进缺氧心肌细胞自噬。该结论进一步丰富了缺氧心肌细胞受损的理论认识,为缺氧心肌损害防治提供了新的靶点。