梅毒是由密螺旋体苍白亚种(Treponema pallidum subsp.Pallidum,T.pallidum,Tp)感染引起的多器官系统损害的慢性传染病。据WHO估计,每年Tp新发病例超过1200万,且感染晚期症状严重,治疗效果不佳,因此,在Tp高危人群中进行有效的疫苗接种和早期预防对Tp防控具有重要意义。我们前期研究证实鞭毛蛋白FlaB3具有良好的免疫原性和致炎作用,在此基础上构建Tp鞭毛蛋白pcDNA3/FlaB3真核载体,初步探索其免疫保护作用。研究发现鞭毛蛋白DNA疫苗(pcDNA3/FlaB3)能诱导高水平的特异性抗体产生和Th1型细胞免疫应答反应,并且可减轻Tp感染部位皮损症状,抑制其向远端器官组织扩散。由于DNA疫苗免疫原性较弱,诱导引起的免疫应答强度和免疫效果也不稳定,而佐剂的使用可以有效解决这一问题。因此选用免疫遗传操作更方便的C57BL/6小鼠作为Tp感染动物模型来评估CpG佐剂增强DNA疫苗的抗感染免疫效果。将两段CpG序列串联插入pcDNA3/FlaB3构建pcDNA3/CpG-FlaB3,在C57BL/6小鼠体内评估CpG改良的DNA疫苗与pcDNA3/FlaB3疫苗的免疫应答和抗感染保护的差异性,进一步对pcDNA3/CpG-FlaB3的保护机制进行评价。本研究为Tp防控及疫苗研发提供新思路和实验依据。Ⅰ梅毒螺旋体鞭毛蛋白DNA疫苗(pcDNA3/FlaB3)在新西兰兔中抗感染免疫保护作用研究目的:评估Tp鞭毛蛋白(FlaB3)DNA疫苗(pcDNA3/FlaB3)免疫新西兰兔后产生的特异性体液免疫和细胞免疫以及减轻Tp感染部位皮损症状、抑制其向远端器官组织扩散的免疫保护性作用。为研制预防和治疗抗Tp感染的DNA疫苗奠定基础。方法:1.鞭毛蛋白FlaB3基因亚克隆到pcDNA3.1构建pcDNA3/FlaB3;利用脂质体将pcDNA3/FlaB3转染到HeLa细胞中,Western blot鉴定其在真核细胞内的表达;2.pcDNA3/FlaB3肌肉注射雄性新西兰兔的股四头肌(每间隔2 w免疫一次,共免疫3次),注射剂量为重组鞭毛蛋白FlaB3(150μg)或pcDNA3/FlaB3(250μg);3.每次免疫后耳缘静脉收集血清标本,间接ELISA法检测新西兰兔血清中IgG抗体水平;4.ELISA试剂盒检测新西兰兔血清中IFN-γ、CD8~+T细胞、IL-6和IL-8的含量;5.末次免疫21 d后,背部皮肤(8个点)皮内注射1×10~7个Tp,每天观察感染部位的皮疹、硬结和溃疡,每隔三天测量皮损的直径,记录皮损出现的时间、大小和溃疡率;6.感染21 d后,麻醉处死新西兰兔,收集皮肤溃疡部位的分泌液,暗视野显微镜记录Tp载量;7.收集感染后新西兰兔的血液、肝脏、脾脏、睾丸组织,提取组织DNA,RT-PCR检测各组织内Tp载量,并对各实验组新西兰兔皮损和睾丸组织作病理切片分析炎症浸润情况。结果:1.成功构建真核质粒pcDNA3/FlaB3,PCR扩增出与预期大小(858 bp)一致的明显条带,Western blot显示在34 kDa处有特异的的免疫反应性条带,而空质粒组(pcDNA3.1)和对照组并未见明显的免疫反应性条带;2.pcDNA3/FlaB3免疫后第2 w即产生鞭毛蛋白特异性抗体,随后抗体水平逐渐增加,第8 w达到最大;3.pcDNA3/FlaB3免疫新西兰兔血清中IFN-γ和CD8~+T细胞的含量明显增加(P<0.01);同时,pcDNA3/FlaB3促进新西兰兔血清中炎症因子(IL-6和IL-8)的分泌;4.各实验组新西兰兔的感染部位在第14 d全部出现皮肤损伤(硬结或溃疡),但对照组免疫的新西兰兔感染部位在第6~8 d即出现皮肤的硬结(100%),而pcDNA3/FlaB3免疫的新西兰兔直到第11~12 d才达到同等程度的皮肤硬结;对照组免疫的新西兰兔在第14 d就出现感染部位的溃疡,而pcDNA3/FlaB3免疫的新西兰兔到第16 d才出现感染部位的溃疡,且皮疹溃疡率明显低于对照组;同时也观察到整个感染期间,pcDNA3/FlaB3免疫的新西兰兔感染部位皮损直径大小明显小于对照组,且对照组新西兰兔皮疹增长速度也明显大于实验组(pcDNA3/FlaB3);暗视野显微镜观察pcDNA3/FlaB3免疫的新西兰兔感染部位皮疹活的Tp载量明显少于对照组,而RT-PCR结果显示pcDNA3/FlaB3免疫的新西兰兔感染部位Tp的载量明显多于对照组,与此相反的是,pcDNA3/FlaB3免疫新西兰兔的肝脏、脾脏、血液、睾丸组织中的Tp载量明显少于对照组(P<0.05);5.pcDNA3/FlaB3免疫新西兰兔感染部位的皮肤病理切片中毛囊孔周围出现大量的炎性细胞浸润(主要包括淋巴细胞、巨噬细胞和浆细胞);而对照组免疫的新西兰兔的睾丸间质也出现大量的淋巴细胞、巨噬细胞和浆细胞等炎性细胞浸润。结论:1.肌肉注射pcDNA3/FlaB3到新西兰兔体内可诱导高水平的特异性鞭毛蛋白抗体和Th1型细胞免疫应答反应;2.pcDNA3/FlaB3免疫新西兰兔可延缓感染部位皮损发展,减轻皮损症状并抑制向肝脏、脾脏和睾丸等远端器官扩散。ⅡCpG改良的梅毒螺旋体鞭毛蛋白DNA疫苗在C57BL/6小鼠中抗感染免疫保护作用研究目的:探索Tp感染的新型动物模型,在上述研究基础上构建CpG ODN改良的鞭毛蛋白(Fla B3)DNA疫苗(pc DNA3/CpG-Fla B3)免疫C57BL/6小鼠,分析其可能的免疫应答机制和免疫保护作用,为研制预防和治疗抗Tp感染的DNA疫苗奠定基础。方法:1.将两段CpG ODN序列串联插入到pcDNA3/FlaB3,构建pc DNA3/CpG-Fla B3。同法将pc DNA3/CpG-Fla B3转染到He La细胞中,Western blot鉴定其在真核细胞中的表达;2.肌肉注射到C57BL/6小鼠体内,每隔2 w免疫一次,共免疫3次。每次免疫后尾部静脉收集血清标本,间接ELISA法检测C57BL/6小鼠血清中Ig G抗体反应。末次免疫14 d后收集脾淋巴细胞,CCK8法检测脾淋巴细胞增殖情况;3.流式细胞术分析pc DNA3/CpG-Fla B3免疫C57BL/6小鼠的脾细胞内T淋巴细胞表型。ELISA试剂盒检测各实验组C57BL/6小鼠脾淋巴细胞上清中的细胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6和IL-10)表达水平;4.末次免疫14 d后,C57BL/6小鼠在皮下(两侧肩胛骨之间)、腹腔和直肠(灌胃)和阴茎海绵体4个部位感染Tp,每个部位的菌液量2.5×106(共1×107)个。每天观察和评估C57BL/6小鼠皮肤和全身系统感染情况;5.感染30 d后,麻醉脱颈处死C57BL/6小鼠,收集小鼠血液、睾丸、淋巴结、肝脏、脾脏和脑组织,RT-PCR和免疫组织化学检测各器官组织内的Tp载量。同时将C57BL/6小鼠(3只/组)腹股沟、臂丛和腋窝的淋巴结分别转染到新西兰兔睾丸内,每天观察新西兰兔睾丸炎症变化,每隔一周进行新西兰兔血清学检测(RPR和TPPA),9 w后麻醉处死新西兰兔,暗视野显微镜和RT-PCR检测睾丸组织Tp载量。结果:1.由上海生工生物工程有限公司成功构建pc DNA3/CpG-Fla B3,菌液PCR鉴定出明显的目的条带,Western blot验证pc DNA3/CpG-Fla B3能在真核细胞内表达;2.pcDNA3/FlaB3(50μg)混合不同浓度的CpG(1μg、10μg、50μg、100μg)免疫C57BL/6小鼠验证CpG的佐剂效应,随着CpG浓度的增加,其抗体水平逐渐增加;3.末次免疫14 d后,pc DNA3/CpG-Fla B3免疫的C57BL/6小鼠脾淋巴细胞增殖指数明显高于对照组,并且多参数细胞内流式细胞术染色(ICS)显示pc DNA3/CpG-Fla B3免疫的C57BL/6小鼠脾淋巴细胞内的CD4+T细胞主要分泌IFN-γ,IL-4的分泌水平没有统计学差异;4.pc DNA3/CpG-Fla B3免疫的C57BL/6小鼠脾淋巴细胞上清中TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-10含量显著增加;5.RT-PCR分析显示pc DNA3/CpG-Fla B3免疫的C57BL/6小鼠血液、淋巴、睾丸、肝脏、脾脏和脑组织内Tp载量与对照组相比明显减少,新西兰兔的淋巴结转染实验显示新西兰兔睾丸内接受pc DNA3/CpG-Fla B3免疫的C57BL/6小鼠淋巴结更早出现Tp血清学反应阳性,其睾丸内的Tp载量也明显多于对照组;6.免疫小鼠的睾丸、肝脏和脾脏免疫组织化学显示对照组免疫的C57BL/6小鼠器官组织内出现大量的Tp。结论:1.pc DNA3/CpG-Fla B3可诱导高水平的特异性鞭毛蛋白抗体产生和Th1型细胞免疫应答;2.pc DNA3/CpG-Fla B3增强免疫小鼠的脾淋巴细胞增值反应;3.CpG佐剂的新型免疫策略增强了梅毒螺旋体鞭毛蛋白(FlaB3)DNA疫苗的免疫保护性效果。