布氏杆菌病是五种世界范围内由细菌引起的传染性人兽共患疾病之一,布氏杆菌为革兰氏阴性,无芽孢,兼性厌氧的胞内寄生菌,分为7个种:Brucella melitensis(羊种), Brucella suis(猪种), Brucella abortus (牛种), Brucella ovis(绵羊种), Brucella canis (犬种), Brucella neotomae (沙田鼠种),以及Brucella maris(海洋种)。造成公共卫生危害的主要是羊种、牛种和猪种布氏杆菌,其中以羊种危害最为严重。血清学监测对动物布氏杆菌病的防控和净化具有极为重要的意义。我国目前应用的布氏杆菌疫苗株包括羊种的M5-90,牛种的A19和猪种的S2。这三种疫苗都存在着疫苗免疫反应与自然感染无法区别的问题,对布病防控带来极大的困扰,迫切需要研发新型标记疫苗。virB12基因是布氏杆菌IV型分泌系统中的编码基因之一,而IV型分泌系统已被证明是布氏杆菌主要的毒力因子,有研究表明VirB12蛋白位于布氏杆菌细胞表面,并可能在侵染宿主细胞时起重要作用。相关研究表明VirB12蛋白能够诱导宿主产生相应抗体,是具有实际应用价值的布氏杆菌病血清学诊断靶抗原。M5-90疫苗株是将羊种M5疫苗株在鸡成纤维细胞上传代90次之后而得到的毒力减弱的疫苗株,在我国得到广泛应用于牛羊的布氏杆菌病防控,其安全性和有效性已经为实践证明。对M5-90疫苗株的virB12基因进行人工缺失,有望获得能够鉴别自然感染和疫苗免疫反应的标记疫苗。为此,本研究首先利用大肠杆菌重组表达了VirB12蛋白,作为检测抗原,建立了检测相应抗原的间接ELISA方法。利用该方法检测了60份布氏杆菌阳性山羊血清及30份布氏杆菌阴性山羊血清,检出符合率为91.7%,证明重组VirB12蛋白对山羊布氏杆菌病的检测具有良好的特异性和敏感性。进一步采用基因组同源重组方法,构建了virB12基因缺失的M5-90疫苗株(M5-90-virB12)。BALB/c小鼠的毒力残留试验结果显示,M5-90-virB12与M5-90免疫小鼠的脾脏重量与荷菌量的消减趋势基本吻合,表明M5-90-virB12与M5-90的生物安全性没有显著差别。BALB/c小鼠进行的攻毒保护实验结果显示,攻毒后M5-90-virB12和M5-90免疫鼠之间的脾脏重量及荷菌量均无显著差异,且与对照组差异显著。同时在一个月之内监测了M5-90以及M5-90-virB12诱导羊产生的抗体水平,两者无明显差异。说明缺失株M5-90-virB12保持了M5-90疫苗的免疫保护效力。综上,本研究验证了VirB12蛋白可以作为布氏杆菌的一种血清学标记,并为布氏杆菌标记疫苗的构建提供了一个新的候选基因。