【摘 要】
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由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)引起的香蕉枯萎病,是目前最具毁灭性的香蕉病害之一。依据Foc对不同香蕉品种的致病性,可将其分为4个小种,其中4
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由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)引起的香蕉枯萎病,是目前最具毁灭性的香蕉病害之一。依据Foc对不同香蕉品种的致病性,可将其分为4个小种,其中4号小种(Foc4)几乎能侵染所有香蕉种类,危害最为严重。纤维素酶作为一类重要的致病因子,可降解寄主植物细胞壁,在病原真菌的致病过程中有重要作用。在前期工作中,本研究室对Foc4分泌蛋白质组进行了研究,发现在香蕉组织诱导后,Foc4中β-1,6-葡聚糖酶的表达量显著上调,并推测其可能与Foc4的致病性相关,但目前还未见Foc4中β-1,6-葡聚糖酶基因功能的相关报道。本论文通过基因克隆、真核表达和基因敲除等方法,首次对Foc4中β-1,6-葡聚糖酶基因的功能进行了研究。具体结果如下:(1)采用实时荧光定量PCR技术,对Foc4中β-1,6-葡聚糖酶基因(Foeg1)的表达量变化进行了验证分析。结果表明,在香蕉组织诱导条件下,Foc4中Foeg1在转录水平的表达显著上调,与分泌蛋白质组的结果相符合。(2)对Foc4中β-1,6-葡聚糖酶基因进行了克隆及测序,成功获得了大小为1381bp的DNA序列和1233 bp的cDNA序列。Foeg1编码蛋白的分子量为46923.26,等电点(pI)为8.27,含有原子总数为6504个,分子式为C2133H3186N572O596S17,理论不稳定指数为28.02。用同种方法对Foc1的β-1,6-葡聚糖酶基因进行了克隆及测序,并将2个小种的β-1,6-葡聚糖酶基因序列进行了比较,发现基因的DNA序列仅存在一个碱基差异,cDNA序列完全相同。(3)成功构建了含Foc4 Foeg1的重组真核表达载体。用甲醇诱导表达,获得了与预期大小相符的目的条带。进一步对其诱导产物的纤维素酶活性进行检测,结果表明,诱导48 h的蛋白能在刚果红平板上产生淡黄色的水解圈,表明其具有纤维素酶活性;采用DNS法,分别对诱导48 h、60 h和72 h后的诱导产物的纤维素酶活性进行了测定,结果表明其纤维素酶比活力大小分别为1.05、1.68、2.05μg/mL·min。(4)通过ATMT介导的基因敲除法,获得了Foc4的β-1,6-葡聚糖酶基因敲除突变体。表型分析结果表明,Foc4-△Foeg1在PDA平板上的生长速率显著低于野生型,且菌落边缘不整齐,菌丝不蓬松,培养第三天开始出现紫红色色素。Foc4-△Foeg1在含1%CMC-Na的SM培养基上的生长速率也显著低于野生型,表明其对纤维素的利用率下降。产孢量统计结果表明,△Foeg1的产孢量显著小于野生型,但孢子萌发无明显差异。致病性分析结果表明,△Foeg1与野生型的致病力没有明显差异。
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