FUS-ERG融合基因阳性AML的分子特征和发病机制研究

来源 :苏州大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hongxingdehong
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一、FUS-ERG融合基因阳性AML的临床特征目的:回顾性分析苏州大学附属第一医院血液科诊断和治疗的7173例AML患者,根据细胞遗传学和融合基因检测的不同结果,分析不同融合基因阳性AML患者的临床特征、细胞遗传学特点以及生存预后的差别。方法:1.完善苏州大学附属第一医院血液科诊断和治疗的AML患者基本信息的采集,系统性分析全部AML患者临床及细胞遗传学特征。2.根据融合基因和细胞遗传学的检测结果,比较不同融合基因亚型AML患者的临床特点及差异。3.详细分析FUS-ERG融合基因阳性AML患者的临床、实验室分子以及预后生存特点。结果:1.7173例AML患者的细胞遗传学特点:正常核型患者3025人,占42.1%;染色体核型未检测或者检测结果丢失的患者占6.5%(463/7173);2.4%(172/7173)的患者染色体核型分析结果显示未见细胞分裂相;49%(3156/7173)的患者染色体核型存在异常,其中 t(15;17),t(8;21),inv(16),t(9;22)分别占 12.3%(884),11.2%(809),1.8%(129),1.4%(103)。2.从2006年起对初诊AML患者进行融合基因检测,共有3984例患者纳入本研究,结果提示融合基因阴性的患者2492例,占62.6%,AML1-ETO,PML-RARa,CBFb-MYH11,BCR-ABL,MLL 重排分别占 12.6%(500),13.2%(527),5.0%(198),1.8%(71),3.8%(152)。其他少见类型的融合基因有 DEK-NUP214(17),FUS-ERG(10),NPM-MLF1(3)和AML1-MTG16(2)。我们对不同融合基因阳性AML患者的临床特征进行分析,发现FUS-ERG融合基因阳性AML患者的发病年龄相对较小,中位发病年龄为24.5岁(8-52岁),与其他融合基因组年龄的差异存在统计学意义(p<0.001),但是检测到的FUS-ERG融合基因阳性的病例数仅为10人,样本数少统计结果可能存在偏差。3.搜集到FUS-ERG融合基因阳性的患者共38例,其中34例为AML患者,占全部AML患者的0.47%(34/7173),3例为急性淋巴细胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia,ALL)以及 1 例急性混合细胞白血病(Mixed-Phenotype Acute Leukemia,MPAL)。对AML患者进行了随访调查,发现FUS-ERG融合基因阳性AML患者的早期死亡(6月内死亡)患者达到17.6%(6/34),一疗程诱导缓解率(complete response,CR)为64.7%(22/34);AML患者中有17例患者进行了造血干细胞移植治疗,发现造血干细胞移植组患者与单纯化疗组患者的总生存率和无事件生存率的存在统计学差异(p=0.0075,p=0.021),移植组患者的预后相对较好;但是移植患者移植后的复发率达到41.2%(7/17),复发患者的治疗效果极差。结论:1.苏州大学附属第一医院血液科AML患者的临床特征和细胞遗传学特点与国际上的报道相类似,染色体核型正常的患者约占42.1%;49%的AML患者染色体核型存在异常,其中 t(8;21),t(15;17),inv(16),t(9;22)分别占 11.2%,12.3%,1.8%,1.4%。2.进行融合基因检测的3984例AML患者,结果提示融合基因阴性的患者占62.6%,AML1-ETO,PML-RARa,CBFb-MYH11,BCR-ABL,MLL 重排阳性分别占12.6%,13.2%,5.0%,1.8%,3.8%;其他少见类型如FUS-ERG融合基因阳性AML患者的发病年龄较小,中位发病年龄24.5岁(8-52岁),与其他融合基因阳性AML患者中位年龄的差异存在统计学意义(p<0.001)。3.0.47%的AML患者可检测到FUS-ERG融合基因,但是FUS-ERG融合基因阳性的患者一共38例,其中34例AML,1例MPAL和3例ALL。在AML患者中,患者早期死亡患者达到17.6%;17患者进行造血干细胞移植治疗,移植患者的复发率达到41.2%(7/17),此类患者的生存预后极差。二、FUS-ERG融合基因阳性患者的分子特征目的:通过全外显子测序技术(Whole exon sequencing technology,WES),全转录组测序(Whole transcriptome sequencing technology,RNA-sequencing)及二代测序技术(next generation sequencing technology,NGS)揭示 FUS-ERG 融合基因阳性 AML 患者的分子生物学特征,并初步探讨其可能的致病机制。方法:1.回顾性分析苏州大学附属第一医院血液科诊断的AML患者的细胞遗传学和分子生物学数据,筛选FUS-ERG融合基因阳性AML患者为研究对象,搜集FUS-ERG融合基因阳性AML患者的DNA或者RNA标本。2.通过WES对10例初诊FUS-ERG融合基因阳性AML患者的DNA标本进行基因突变检测,寻找共同伴随基因突变特征。3.通过RNA-sequencing对10例初诊FUS-ERG融合基因阳性AML患者的RNA标本进行基因表达和融合基因的检测,分析FUS基因和ERG基因断裂融合方式,以正常核型和其他类型AML患者作为对照,分析FUS-ERG融合基因阳性AML患者的基因表达特征及与其他类型AML患者的基因表达差异,寻找FUS-ERG融合基因可能的致病机制。4.采用包含51个血液肿瘤相关基因的靶向NGS,对13例初诊FUS-ERG融合基因阳性AML患者的DNA标本进行基因突变检测,进一步揭示其基因突变特征。结果:1.搜集到10例FUS-ERG融合基因阳性AML患者的初诊骨髓细胞DNA标本进行全外显子测序,分析测序结果显示:出现6次以上的重现性突变基因有RPL14、MUC4、LNP1、CAMKK2、FADS6、NBPF14,未检测到常见的 AML 基因突变。2.搜集到10例FUS-ERG融合基因阳性AML患者的初诊骨髓细胞RNA标本进行RNA-sequencing检测,分析这组病人和正常核型急性髓系白血病患者基因表达差异,FUS-ERG融合基因阳性AML患者显著上调的通路有肿瘤信号转导通路、PI3K-Akt信号转导通路以及Rap1超RAS信号转导通路;通过和其他类型的AML患者的基因表达的GSEA分析,发现两者存在差异信号通路是主要是代谢相关通路:包括抗环血酸和醛酸代谢通路,半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路以及组氨酸代谢通路。3.搜集到13例FUS-ERG融合基因阳性AML患者的初诊骨髓细胞DNA标本进行靶向NGS测序,一共检测到20个基因突变,其中PTPN11激活性突变出现次数最多,频率为30.8%(4/13),其次是WT1突变,推测PTPN11突变可能对疾病的发生进展起到重要的作用。结论:通过和其他类型的急性髓系白血病患者的基因表达的GSEA分析,发现两者存在差异的通路主要是代谢相关通路:包括抗环血酸和醛酸代谢通路,半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路以及组氨酸代谢通路。血液肿瘤相关基因的二代靶基因深度测序共检测到20个基因突变,其中PTPN11激活性突变出现次数最多(4/13),推测PTPN11激活性突变可能对疾病的进展起重要作用。三、FUS-ERG融合基因的致白血病机制研究目的:应用体外和体内实验模型,阐述FUS-ERG融合基因的致白血病机制。方法:1.构建FUS-ERG融合基因过表达慢病毒质粒载体,三质粒系统包装慢病毒,分别在HL-60以及32D细胞株中稳定过表达,探究FUS-ERG融合基因在体外细胞株中对细胞增殖、凋亡以及分化的作用。2.构建逆转录病毒表达载体,转染人脐血CD34阳性的细胞,流式分选CD34+GFP+细胞,进行原代细胞克隆形成和液体培养髓系诱导分化实验,观察克隆数目和类别的差异,以及其对原代细胞分化能力的影响。3.构建慢病毒过表达载体,将PTPN11-WT、PTPN11-D61V、PTPN11-E76K突变体分别在32D-Venus与32D-FUS-ERG细胞中过表达,研究PTPN11-WT及突变体对细胞增殖和分化能力的作用。4.构建慢病毒过表达载体,转染Balb/c小鼠骨髓CD117阳性细胞,胫骨原位移植到同种Balb/c小鼠骨髓内,观察移植后小鼠的发病情况。5.构建Vav-1为启动子的FUS-ERG融合基因敲入小鼠模型,观察小鼠的发病情况。结果:1.成功构建FUS-ERG融合基因慢病毒表达载体,感染人白血病细胞株,研究结果显示FUS-ERG融合基因可导致HL-60细胞增殖增多和凋亡减少,亦可以引起32D细胞分化阻滞。2.成功分选脐血中CD34阳性细胞,感染逆转录病毒,研究结果显示FUS-ERG融合基因可引起脐血细胞克隆形成能力增加,多潜能集落形成单位比例增加,髓系成熟分化阻滞,流式细胞学检测细胞阻滞在干祖细胞及早幼粒细胞阶段。3.在体外,FUS-ERG融合基因可协同PTPN11激活性突变,引起PI3K-AKT信号通路激活,导致32D细胞增殖能力显著增加以及髓系成熟分化阻滞,促使下游基因HIF-1a、IKKa、Casp9 基因的下调。4.在小鼠骨髓移植模型体内实验中,检测移植后小鼠的生存情况,结果显示FUS-ERG融合基因移植小鼠全部死亡,载体对照组小鼠仅死亡一只,两组小鼠总生存率存在显著的统计学差异(p=0.075)。小鼠进行流式细胞学以及病理切片HE染色观察,结果显示单独FUS-ERG融合基因可导致移植小鼠发病,但是小鼠疾病的发生骨髓原始细胞增多,同时表达CD3和/或ter1 19的阳性细胞,发病形式不统一,此和临床上FUS-ERG融合基因的疾病发生类型相似。结论:1.FUS-ERG融合基因可导致HL-60细胞增殖能力增加,细胞凋亡减少;亦可以引起32D细胞髓系成熟分化阻滞。2.FUS-ERG融合基因引起脐血细胞克隆形成能力增加,髓系成熟分化阻滞,分化阻滞在干祖细胞及早幼粒细胞阶段。3.FUS-ERG融合基因协同PTPN11突变,引起PI3K-AKT信号通路激活,导致32D细胞增殖能力增加和髓系分化阻滞,下游HIF-1a、IKKa、Casp9基因下调。4.单独FUS-ERG融合基因可导致移植小鼠发病,但是小鼠疾病的发生类型多样,此结果和临床上FUS-ERG融合基因的发生白血病的类型相似。
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