论文部分内容阅读
近年来,经皮椎体成形术（Percutaneous vertebroplasty,PVP）逐渐被用于转移性骨肿瘤治疗中。聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate,PMMA）骨水泥是PVP术中最常用的填充材料,其注入椎体后不但可起到可加固病椎缓解疼痛的作用,还可通过聚合时高热以及MMA单体的毒性杀伤肿瘤,但单纯PMMA骨水泥的抗肿瘤作用弱,疗效不持久。免疫治疗是当前肿瘤治疗的研究热点,大量的研究证实通过免疫治疗可以有效地清除机体内残留或转移的肿瘤细胞。抗原提呈细胞识别与呈递肿瘤抗原是机体抗肿瘤免疫应答中最重要的环节。免疫调节剂—咪喹莫特（Imiquimod）又称R837,是常见的Toll样受体-7（Toll-like receptor-7,TLR-7）激动剂,可以通过促进树突状细胞（Dendritic cells,DCs）成熟发挥免疫调节作用,但单纯应用R837并不能引起强效的抗肿瘤免疫应答。抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4抗体（anti-cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4 antibody,aCTLA4ab）是一种可以提高机体免疫细胞杀伤作用的免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor,ICI）,并已在临床应用。因此,我们设想将R837负载于PMMA骨水泥上构建具有免疫调节作用的新型骨水泥,同时联合ICI增强新型骨水泥产生的抗肿瘤免疫反应。本课题通过多个肿瘤模型对新型骨水泥联合ICI的治疗肿瘤的疗效进行了实验研究,初步探索了联合治疗的机理,期望研究结果为骨转移肿瘤治疗提供新视角和新思路。第一部分 负载TLR-7激动剂的新型PMMA骨水泥表征及性能的实验研究目的:构建负载R837的PMMA骨水泥（R837-PMMA）,研究其表征特性及体内免疫调节作用。方法:通过超声波助溶将R837与甲基丙烯酸甲酯单体（MMA）混合成为R837-MMA,将PMMA粉末与MMA按质量体积比3:2的比例混合并充分搅拌制成R837-PMMA。应用红外热成像仪分别测定PMMA与R837-PMMA聚合时温度变化。通过高效液相色谱分析法测定R837-PMMA在缓冲液溶液中R837的释放情况,使用扫描电子显微镜观察R837-PMMA微观结构。用MMT法检测R837-PMMA骨水泥对不同肿瘤细胞增殖的影响,通过小鼠CT26皮下肿瘤模型研究R837-PMMA在体内对DCs成熟的影响。结果:在R837-PMMA扫描电镜图像中可见小分子R837附着于其表面。PMMA与R837-PMMA聚合过程均能释放大量热量,达到较高温度并持续较长时间,负载R837会降低骨水泥聚合时的最高温度（t=11.352,p<0.001）。R837可从PMMA中缓慢释放,3小时释放约15.24%。两种骨水泥均能抑制体外培养的肿瘤细胞增殖,负载R837后骨水泥细胞毒性无明显增强。体内实验表明R837-PMMA瘤内注射后,引流淋巴结中成熟DCs 比例平均达41.63%,优于单纯PMMA骨水泥（p=0.015）。结论:本实验研究成功制备了具有免疫调节功能的R837-PMMA骨水泥,且升温效果满意,附着在骨水泥上的R837可在该体系内缓慢释放,促进DCs成熟迁移。第二部分 负载TLR-7激动剂的新型PMMA骨水泥抑制远处肿瘤的实验研究目的:研究R837-PMMA治疗原发肿瘤后对远处肿瘤的抑制作用,并探讨R837-PMMA治疗对免疫系统的影响。方法:通过VX2瘤块接种建立兔椎旁原发肿瘤以及远处皮下肿瘤模型,随机分为未治疗对照组、PMMA组和R837-PMMA组,每组6只。针对椎旁原发肿瘤给与PMMA与R837-PMMA组于CT引导下瘤内注射骨水泥。观察远处肿瘤大小变化,血清细胞因子水平以及实验动物生存期等指标,评价R837-PMMA治疗原发肿瘤后远处肿瘤生长。随后,以上述方法再次建立一批椎旁肿瘤模型,每组3只,观察未治疗对照组与PMMA组、R837-PMMA组治疗后兔外周血T细胞亚群变化。结果:R837-PMMA组兔VX2椎旁原发肿瘤治疗后,远处皮下肿瘤的生长也受到抑制,该组兔生存时间较对照组与PMMA组延长。ELISA检测显示R837-PMMA治疗后兔血清IFN-γ和TNF-α水平明显升高。流式细胞检测表明R837-PMMA治疗后外周血中CD4+T细胞和CD8+T细胞含量升高最明显,其中CD8+T细胞含量为10.91±1.92%,显著高于对照组（p=0.002）与 PMMA 治疗组（p=0.012）。结论:本研究证实新型R837-PMMA骨水泥肿瘤内注射可抑制远处肿瘤生长,并引起外周血CD4+T细胞与CD8+T细胞增加。第三部分负载TLR-7激动剂的新型PMMA骨水泥联合抗CTLA-4抗体抑制远处肿瘤与转移的实验研究目的:研究R837-PMMA联合aCTLA4ab治疗原发肿瘤后对远处肿瘤及转移的抑制作用。方法:建立CT26双边肿瘤和Luc-4T1乳腺原位肿瘤等2个小鼠模型,各组小鼠治疗后通过测量CT26远处肿瘤大小,及小动物活体成像监测乳腺癌转移,ELISA法检测各组TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL12p70等血清细胞因子水平以及观察生存期等方法评价R837-PMMA骨水泥联合aCTLA4ab治疗抑制远处肿瘤及转移的疗效。结果:在小鼠CT26双边肿瘤模型中,R837-PMMA联合aCTLA4ab治疗原发肿瘤后,远处肿瘤生长显著受抑制,肿瘤体积显著小于其余4组（p<0.001）。在小鼠Luc-4T1乳腺癌原位模型中,小动物活体成像提示联合治疗显著抑制并延缓转移的发生。R837-PMMA联合aCTLA4ab在小鼠CT26双边肿瘤和Luc-4T1乳腺癌原位肿瘤模型中均能显著延长小鼠存活时间,并显著升高血清中TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL12p70等细胞因子水平。结论:本研究证实R837-PMMA肿瘤内注射可引起抗肿瘤免疫反应抑制远处肿瘤,联合aCTLA4ab可增强其抗肿瘤免疫反应,能够进一步抑制远处肿瘤生长与转移发生。第四部分负载TLR-7激动剂的新型PMMA骨水泥联合抗CTLA-4抗体产生抗肿瘤免疫反应的机理研究目的:研究R837-PMMA联合aCTLA4ab能否产生免疫记忆效应抑制肿瘤,并探讨联合治疗抑制远处肿瘤、转移和复发的机理。方法:建立小鼠CT26双边肿瘤模型,随机分为手术、PMMA、R837-PMMA、PMMA+aCTLA4ab和R837-PMMA+aCTLA4ab等5组,每组3只。各组原发肿瘤治疗后第7天收集远处肿瘤,流式细胞检测观察远处肿瘤内CD8+细胞毒性T细胞（CTL）、CD4+效应T细胞（Teff）、调节性T细胞（Treg）的含量。建立小鼠CT26单侧肿瘤模型随机分组同前,每组9只,肿瘤治疗后第40天,每组处死3只小鼠并通过流式细胞检测观察脾脏中中枢记忆T细胞（TCM）与效应记忆T细胞（TEM）含量。剩余每组6只小鼠再次接种CT26肿瘤细胞,观察肿瘤大小、生存期、治疗后第6日血清TNF-α、IFN-γ水平等指标,评价各组治疗后是否产生免疫记忆效应。结果:R837-PMMA联合aCTLA4ab治疗原发肿瘤后,远处肿瘤内CD3+T细胞比例最高,其中该组CD8+CTL含量平均为13.31%,伴有CTL/Treg比值与Teff/Treg比值显著升高。此外,R837-PMMA联合aCTLA4ab治疗组小鼠再次接种肿瘤前TEM比例显著高于其他组,再次接种肿瘤后第6天血清TNF-α、IFN-γ水平显著升高,且肿瘤生长较其余4组明显抑制,生存期显著延长。结论:R837-PMMA联合aCTLA4ab治疗可通过促进T细胞特别是CD8+CTL浸润至远处肿瘤内,并通过aCTLA4ab阻断Treg对T细胞的抑制作用增强抗肿瘤免疫应答,还可通过产生强力的免疫记忆效应清除再次接种肿瘤细胞,具有抑制复发的作用。