第一部分 C-型凝集素域家族3成员B影响肺癌细胞侵袭、迁移的分子机制研究目的:研究C-型凝集素域家族3成员B（C-Type Lectin Domain Family 3 Member B,CLEC3B）在肺癌中的基因变化,研究该基因高表达对肺癌细胞侵袭、迁移的影响并探究其调控的分子机制,挖掘该基因作为肺癌诊断标志物的潜在可行性,为寻求治疗肺癌的分子靶向药物或临床病理诊断提供科学依据。方法:（1）2017年1月到2017年8月收集肺癌组织30例,在冰上分离肿瘤组织和癌旁组织进行转录组测序,检测肺癌组织中基因表达水平的变化。GO（Gene ontology）分析异常基因的功能与机制,利用Pathway分析进一步了解基因参与的代谢通路及具体的生物学功能。（2）分析CLEC3B在TCGA数据库中的表达情况（LUAD:肺癌腺癌,肿瘤组织样本总数（T）:483例,癌旁组织样本总数（N）:347例,LUSC:肺鳞癌,肿瘤组织样本总数（T）:486例,癌旁组织样本总数（N）:338例）,并分析CLEC3B表达高低与肺癌患者总生存期之间的关系。（3）qRT-PCR检测CLEC3B在肺癌组织和癌旁组织中的mRNA表达水平。（4）免疫组化检测CLEC3B蛋白的表达水平,并与患者临床信息进行综合分析。（5）qRT-PCR和Western blot法检测常见肺癌细胞系（211H、95D、H441、A549）和人正常肺上皮细胞BEAS-2B内的CLEC3B的mRNA和蛋白水平。并建立CLEC3B过表达肺癌细胞系,使用qRT-PCR和Western blot法验证构建成功与否。（6）CCK-8法和台盼蓝染色检测过表达CLEC3B对肺癌细胞增殖功能的影响。（7）克隆形成试验测定过表达CLEC3B的肺癌细胞增殖能力。（8）划痕实验和Transwell侵袭实验过表达CLBC3B的肺癌细胞迁移和侵袭能力。（9）Western blot法检测PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达水平,考察过表达CLEC3B对PI3K/Akt信号通路的影响。（10）Western blot法检测MAPK信号通路相关蛋白表达水平,考察过表达CLEC3B对MAPK信号通路的影响。（11）把慢病毒载体构建好的CLEC3B稳定过表达A549细胞株以及其对应的空载体对照细胞株,通过与等体积Matrigel胶混合后接种裸鼠皮下进行成瘤实验,监测肿瘤大小（体积）,并用Western blot法检测荷瘤组织关键信号分子的蛋白表达水平,以进一步验证体外实验结果。综合上述体外和体内实验结果阐明过表达CLEC3B抑制肺癌进展、验证体外分子调控机制。结果:（1）肿瘤组织中共有3818个基因的mRNA表达水平发生明显的改变,其中1530个基因的mRNA表达水平显著增加（P<0.05）（如AFAP1、RP11、GRP110、MMP13、TCN1、GLB1L3、KCNQ3、TOX3、HABP2、SGPP2、TMPRSS4、STK32A、MROH6、FAM83A、IL37等）,2288个基因的mRNA转录水平显著降低（P<0.05）（如 RTKN2、CLEC3B（变化差异显著性第二）、UPK3B、GPM6A、BTNL9、AATK、MYRF、GKN2、ITLN2、ARHGEF26、CRYAB、EGFL7、KCNK3、HIF3A、RASIP1、FOXF1、GRASP、GRK5、CLIC3、RAMP2等）,这提示基因的异常表达与肺癌的发生、发展密切相关。GO分析得出癌组织中的过表达基因主要参与调控细胞的生物过程和细胞组成,而肺癌组织中的下调表达基因主要参与调控细胞的分子功能。Pathway分析结果显示:1530个表达上调的基因中有94个基因参与调控代谢通路（metabolic pathways）,35个基因参与调控磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路（PI3K-Aktsignaling pathway）,其次是细胞因子受体互作（Cytokine-Cytokine receptor interaction）。同时对2288个表达下调的基因中分析却发现54个基因调控神经活性配体受体互作（Neuroactive ligand-receptor interaction）,MAPK 信号通路（MAPK signaling pathway）,也激活磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路（PI3K-Aktsignaling pathway）。表明在上调基因和下调基因可能通过激活细胞内容关键信号通路,从而促进肺癌的发生与发展过程。（2）分析CLEC3B在TCGA数据库中的表达情况发现与癌旁组织相比,CLEC3B基因在肺癌组织的表达量显著降低（P<0.05）,CLEC3B高表达患者的总生存显著高于该基因低表达患者（P<0.01）。（3）qRT-PCR检测结果显示,与癌旁组织相比,CLEC3B在肿瘤组织中显著降低（P<0.01）。（4）CLEC3B的表达高低与患者的年龄、性别、和吸烟史没有显著相关性,但与患者的TNM分期、肿瘤大小具有显著性（P<0.05）。（5）在人正常肺上皮细胞BEAS-2B内CLEC3B基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平均显著高于其它肺癌肿瘤细胞系,而肺癌细胞系中A549的CLEC3B基因mRNA和蛋白表达水平最低,本项目选择CLEC3B低表达的细胞系A549细胞进行功能研究和机制探索,并成功建立CLEC3B过表达的A549细胞系。（6）过表达CLEC3B 24 h和48 h时对A549细胞的增殖能力没有显著变化,但随着培养时间的延长,从72h开始过表达CLEC3B开始显著抑制A549细胞的活性（P<0.05）。（7）与空白对照组（Vector）相比,过表达CLEC3B后能显著抑制A549细胞克隆形成数目（P<0.05）。（8）与空白对照组（Vector）相比,过表达CLEC3B能显著抑制A549细胞迁移能力（P<0.01）,过表达CLEC3B能显著抑制肺癌细胞A549的侵袭能力,抑制率达到58%（P<0.01）。添加Matrigel胶后,过表达CLEC3B也能显著抑制A549细胞的侵袭能力,抑制率达到48%（P<0.01）。（9）过表达CLEC3B能显著抑制PI3K蛋白的磷酸化水平（p-PI3K）（P<0.05）,对PI3K总蛋白的表达没有明显变化（t-PI3K）;过表达CLEC3B能显著抑制Akt蛋白的磷酸化（p-Akt）（P<0.05）,对Akt总蛋白的表达没有明显变化（t-Akt）。对蛋白条件进行灰度分析显示,过表达CLEC3B显著抑制磷酸PI3K蛋白/PI3K总蛋白的的比率（p-PI3K/t-PI3K）（P<0.05）,也能显著抑制磷酸化Akt蛋白/Akt总蛋白的比率（p-Akt/t-Akt）（P<0.05）。（10）在 A549 细胞中,过表达 CLEC3B 对磷酸化 JNK（p-JNK）、总JNK蛋白表达（t-JNK）、磷酸化p38（p-p38）和总p38蛋白的表达（t-p38）没有显著的影响;对蛋白条带进行灰度分析后也显示过表达CLEC3B对磷酸化JNK/总JNK蛋白的比率（p-JNK/t-JNK）、磷酸化p38/总p38蛋白的比率（p-p38/t-p38）没有显著的改变。另一方面,过表达CLEC3B能显著降低磷酸化ERK（p-ERK）的水平（P<0.05）;对蛋白条带进行灰度分析后也显示过表达CLEC3B对磷酸化ERK/总ERK蛋白的比率（p-ERK/t-ERK）显著降低（P<0.05）。（11）在A549细胞中,与空白对照组（Vector）相比C,过表达的CLEC3B（Over-CLEC3B）能显著抑制肺癌细胞在裸鼠体内的增殖能力,两者具有统计学意义（P<0.01）。同时与空白对照组（Vector）相比,过表达的CLEC3B（Over-CLEC3B）肿瘤组织的重量降低（P<0.05）。Western blot检测结果显示与空白对照组（Vector）相比,过表达的CLEC3B（Over-CLEC3B）裸鼠皮下肿瘤组织中ERK分子和Akt分子活性显著降低（P<0.05）,即磷酸化水平降低。结论:（1）CLEC3B基因在肺癌组织中低表达,与肺癌患者的TNM分级具有显著相关性,此外,CLEC3B高表达患者的总生存显著高于该基因低表达患者,这表明CLEC3B表达水平的高低可作为影响肺癌患者生存期的一个重要预测标志物。（2）在肺癌细胞系A549中,过表达CLEC3B能显著抑制细胞增殖、克隆形成能力、侵袭和转移能力。（3）分子机制研究显示:过表达CLEC3B能显著抑制PI3K、Akt和ERK信号分子的磷酸化,进而抑制该PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路活性。（4）体内实验显示:过表达CLEC3B能够抑制裸鼠皮下肺癌肿瘤的生长、Akt和ERK信号分子的磷酸化水平。第二部分 血清CLEC3B作为评估局部晚期新辅助化疗后非小细胞肺癌疗效的肿瘤标志物目的:考察CLEC3B在局部晚期非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）患者行新辅助化疗（Neoadjuvant chemotherapy,NACT）的疗效评估中的临床价值,比较CLEC3B与其他肿瘤标志物的特异性和敏感性。方法:纳入60例2018年1月至2018年6月在南通市肿瘤医院初诊的TNM分期Ⅲ期的非小细胞肺癌患者为受试对象,同时纳入50例同期体检健康人为对照组。（1）对NSCLC患者行新辅助化疗治疗,完成化疗后评估患者的短期疗效。（2）收集健康人及NSCLC患者行NACT治疗前后的血清,采用ELISA法测定血清CLEC3B。（3）分析患者临床特征与血清CLEC3B水平的相关性。（4）ELISA法测定NSCLC患者血清 CYFRA21-1、CEA、NSE 水平,qRT-PCR 法检测 cfDNA 浓度。（5）建立 CLEC3B、CYFRA21-1、CEA、NSE 和 cfDNA 的 ROC 曲线。结果:（1）60例局部晚期NSCLC患者经NACT治疗后近期疗效为CR患者0例,PR患者32例,SD患者26例,PD患者2例。（2）ELISA法检测血清CLEC3B水平,结果显示局部晚期NSCLC患者经NACT治疗前血清CLEC3B水平为42.04±10.39 ng/ml,显著低于健康人（P<0.05）,进行两个周期的NACT治疗后NSCLC患者的CLEC3B水平为68.26±15.53 ng/ml,较化疗前显著升高（P<0.05）。进一步统计不同疗效人群中CLEC3B水平的差异,发现PR患者CLEC3B水平为75.38±12.14 ng/ml,SD 患者 CLEC3B 水平为 67.21±13.59 ng/ml,PD 患者 CLEC3B 水平为 59.32±10.18 ng/ml,PD患者的血清CLEC3B水平显著低于PR患者（P<0.05）。（3）分析局部晚期NSCLC患者临床病理参数与血浆CLEC3B水平的相关性发现,无论是NACT治疗前或NACT治疗后,血浆CLEC3B水平与局部晚期NSCLC患者的性别、年龄、肿瘤病理类型、有无吸烟史、肿瘤大小及肿瘤位置均无显著相关性（P>0.05）,而与NSCLC患者的淋巴结转移情况、TNM临床分期及分化程度显著相关（P<0.05）。（4）检测CYFRA21-1、CEA、NSE、cfDNA水平,NSCLC患者经NACT治疗前的血清CYFRA21-1、CEA、NSE、cfDNA 水平显著高于健康人（P<0.05）;NSCLC 患者经NACT治疗后血清CYFRA21-1、CEA、NSE、cfDNA水平较治疗前显著降低（P<0.05）。（5）建立ROC曲线比较各指标的敏感性和特异性,发现CLEC3B的曲线下面积（Area under the curve,AUC）较小,其敏感性和特异性较低。结论:血清CLEC3B水平在局部晚期NSCLC患者中显著降低,经NACT治疗后其水平显著提高,对于临床上监测局部晚期NSCLC患者经NACT治疗的疗效具有重要价值,有望成为局部晚期NSCLC患者疗效评估的生物指标,为后期个性化治疗方案的制定、提高生存率提供辅助作用。