蜡质芽胞杆菌AR156(缩写为Bc AR156)是本实验室前期从森林树木根围土壤中分离的一株植物根围促生细菌(PGPR),可广谱性防治茄劳尔氏菌引起的蔬菜青枯病、辣椒疫霉引起的疫病、尖孢镰刀菌引起的枯萎病和南方根结线虫引起的根结线虫病。目前该菌株已经获得相关专利,完成全基因组解析,获得防治番茄根结线虫病害的生物农药正式登记证。前期研究发现Bc AR156能够诱导拟南芥产生对丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonassyringae pv.tomato,以下简称Pst)DC3000系统抗性;机理研究表明,Bc AR156诱导拟南芥产生的系统抗性是通过同时激活水杨酸以及茉莉酸/乙烯两条信号通路,同时具有NPR1依赖性。为什么Bc AR156能同时激活拟南芥体内这两条信号通路,而其他生防因子如荧光假单胞菌、部分芽胞杆菌只能激活其中的某一条信号途径?Bc AR156如何被植物体识别,从而激活植物体的系统抗性?在Bc AR156诱导抗性过程中植物内源small RNA的调控作用是什么?除了上述广谱抗病机理外,既然根结线虫与其他病原物的致病机理完全不同,Bc AR156又是如何高效特异性地防治蔬菜根结线虫病害的?这些关于Bc AR156的生防机理问题的解决,将能更有效地推广使用生物农药活菌制剂,推动微生物农药产业的发展。本研究以Bc AR156为生防菌,以拟南芥、番茄为模式植物,以Pst DC3000、南方根结线虫为模式病原,进行三者互作研究,探究生防菌防病机理。本研究首先从转录因子角度出发,清楚地解析了 Bc AR156诱导抗病性机理,最终筛选发现Bc AR156分泌的胞外多糖(EPS)能够作为一种微生物相关分子模式(MAMPs),被植物体表面模式识别受体识别,进而激活植物体自身防卫反应;同时发现植物内源miRNA:miR472和miR825/825*也参与调控Bc AR156诱导系统抗性过程。针对根结线虫的特异性生防机理研究发现,Bc AR156一方面能够改变番茄根系结构,促进番茄根系的快速成熟,从而降低根结线虫对番茄根系的侵染概率;另一方面Bc AR156还能抑制根结线虫某些效应因子编码基因的表达,降低其对番茄的致病力,最终达到高效防治番茄根结线虫的效果。1.转录因子WRKY70和WRKY11在调控蜡质芽胞杆菌AR156诱导系统抗性过程中的作用机理研究以拟南芥为模式植物探寻转录因子WRKY70和WRKY11在Bc AR156诱导系统抗性过程中所起作用。结果表明,Bc AR156处理拟南芥后,能够显著提升植物体内转录因子WRKY70的表达量,同时显著抑制WRKY11的表达。研究还发现转录因子WRKY70和WRKY11为Bc AR156诱导细胞防卫反应以及防卫相关基因的表达所必须。过量表达转录因子WRKY70和WRKY11能够影响Bc AR156诱导拟南芥产生对Pst DC3000的抗性。突变体验证结果显示:Bc AR156诱导抗性的能力在转录因子WRKY70和WRKY11单突变体拟南芥植株中能够保留,但抗性能力略微下降,然而在WRKY70和WRKY11双突变体植株中则完全丧失。以上结果表明,转录因子WRKY70和WRKY11是通过两条不同途径调控Bc AR156诱导系统抗性的,并且这两条途径之间具有协调作用。转录因子WRKY70和WRKY11靶标分析结果表明:WRKY70通过水杨酸信号通路,WRKY11通过茉莉酸信号通路来调控Bc AR156诱导的系统抗性,而且这两条调控通路之间具有NPR1的依赖性。综合上述结果,发现转录因子WRKY70和WRKY11在调控Bc AR156诱导系统抗性过程中起着重要的作用。本研究也是首次从转录因子角度出发,阐明根围有益微生物如何同时激活水杨酸、茉莉酸/乙烯两条信号通路,来诱导寄主植物对病原菌的抗性。2.蜡质芽胞杆菌AR156胞外多糖作为一类MAMPs激活植物系统免疫在诱导系统抗性过程中,植物体对Bc AR156的早期识别起着重要作用。本研究结果表明,Bc AR156分泌的胞外多糖能够诱导拟南芥产生对Pst DC3000的系统抗性;在此过程中,能够提升防卫相关基因PR1、PR2、PR5以及MAPK激酶MPK6的上调表达;另外,也能够激活植物体细胞防卫反应如活性氧爆发、胼胝质沉积以及防卫相关酶活性的提升。基因上位性分析结果显示,Bc AR156胞外多糖仍能够在信号通路突变体jar1、etr1中诱导对Pst DC3000的系统抗性,与野生型Col-0相比,其在突变体jar1、etr1中诱导抗性能力略有降低;在NahG转基因植物以及npr1突变体中,Bc AR156胞外多糖的诱导抗性能力丧失。以上结果表明,Bc AR156胞外多糖诱导的系统抗性依赖MAMPs信号识别和水杨酸信号通路转导,并且具有NPR1依赖性。综上所述,Bc AR156胞外多糖在Bc AR156诱导系统抗性过程中,作为一类MAMPs,发挥着重要的作用。3.Sma11 RNAs在生防菌诱导植物抗病中的调节作用为研究植物内源small RNA在调控植物诱导抗性的机理,本研究利用deep sequencing以及生物信息学技术,筛选获得一些参与调控植物诱导抗性的miRNA。Northern Blot验证试验结果显示,在Bc AR156诱导拟南芥产生对Pst DC3000的抗性过程中,miR472,miR825和miR825*三种miRNA在Bc AR156处理的拟南芥叶片内被显著下调。对上述miRNA靶标预测结果显示,miR472,miR825和miR825*的靶标主要参与植物基础免疫,其中miR825靶标主要一些泛素蛋白连接酶;miR472和miR825*的靶标主要是一些参与ETI途径的R基因。研究发现上述预测的靶基因的表达受到miRNA负向调控。另外,miRNA缺失突变体表现出对病原细菌Pst DC3000的抗性。与此相反,miRNA过表达转基因植株对病原菌更敏感。综上所述,BcAR156通过抑制miR472、miR825和miR825*三种miRNA的表达,引起其靶标基因的上调,从而激活植物体自身的防卫反应,诱使植物产生系统抗性。4.蜡质芽胞杆菌AR156调控植物根系发育防治根结线虫病害的机理研究本研究发现,Bc AR156处理番茄根系能够诱导其结构变化;加速根系的成熟化(如根毛增多,根毛区比例显著增加),从而降低根结线虫进入植物体内的概率;减少植物根系内根结线虫的虫口数,从而获得防治根结线虫的效果。为探究Bc AR156防治根结线虫的机理,我们从植物根系结构发育角度出发,利用转录组学分析技术,探究Bc AR156改变植物根系结构防治根结线虫的分子机理。转录组结果显示,Bc AR156能够引起植物体内一系列与发育相关基因的表达,其中最为显著的是与脱落酸、乙烯、热激蛋白相关的基因,定量PCR验证结果与预测结果相同。综上所述,Bc AR156能够调控一些与脱落酸、乙烯、热激蛋白相关的基因,来调控植物根系的发育;加速根系的成熟化,进而诱导植物抵抗根结线虫的侵染。5.蜡质芽胞杆菌AR156调控根结线虫效应因子表达防治病害的机理研究研究发现利用Bc AR156预处理植物后接种根结线虫,能够显著降低线虫的侵染,为深入探究其生防机理,本研究利用转录组学分析技术进行研究。结果显示,Bc AR156处理能够抑制根结线虫效应因子编码基因的下调表达;Q-RT-PCR验证发现有11个效应因子的表达受到Bc AR156的抑制。本研究首次发现,生防菌能够通过抑制根结线虫效应因子的表达而降低根结线虫的致病力,以达到防治目的。