【摘 要】
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拟南芥EARLI1蛋白是脂质转移蛋白(LTP)家族的一个成员,它的8CM与植物nsLTP在结构上具有很高的相似性。已有的研究结果显示EARLI1对维持细胞膜或细胞壁的稳定性有一定作用,它还可能在角质和蜡质的形成、胚胎发生、防御病原菌侵染以及帮助植物适应不同的环境条件等方面具有功能。本工作通过大肠杆菌原核表达体系制备了EARLI1重组蛋白,研究了它对真菌病原体的抗性功能。在构建原核表达载体时,以野生
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拟南芥EARLI1蛋白是脂质转移蛋白(LTP)家族的一个成员,它的8CM与植物nsLTP在结构上具有很高的相似性。已有的研究结果显示EARLI1对维持细胞膜或细胞壁的稳定性有一定作用,它还可能在角质和蜡质的形成、胚胎发生、防御病原菌侵染以及帮助植物适应不同的环境条件等方面具有功能。本工作通过大肠杆菌原核表达体系制备了EARLI1重组蛋白,研究了它对真菌病原体的抗性功能。在构建原核表达载体时,以野生型Col-0拟南芥基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增产生缺少信号肽编码序列的EARLI1基因,然后用BamH I和Xho I对目的片段进行双酶切,与BamH I和(hoI双酶切的pET-28a进行连接。进一步将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用[PTG诱导EARLI1重组蛋白的表达。目的蛋白的检测采用SDS-PAGE电泳和Western免疫印迹方法,纯化采用亲和层析方法。SDS-PAGE电泳分析结果显示,在大肠杆菌细胞中表达的缺少信号肽的EARLI1重组蛋白主要以包涵体的形式存在。在体外抑菌实验中,EARLI1重组蛋白对蒜薹灰霉菌的生长有很强的抑制效果。在液体培养基中加入EARLI1重组蛋白,酵母细胞的分裂能力明显降低。为了进一步证实EARLI1(?)勺抑菌活性,将PCR扩增产生的完整的EARLI1开放阅读框连接至(?)pESC-URA载体中的GAL1启动子之后,用半乳糖进行诱导,发现在细胞内表达EARLI1也可以阻止酵母细胞的分裂。本工作还采用植物病原体丁香假单胞菌ES4326对Col-0野生型和EARLI1过表达植株进行了侵染分析。苔盼蓝染色结果显示,与EARLI1过表达植株叶片相比,野生型植株叶片上存在更多的死亡细胞。DAB染色发现过表达植株叶片上的病原体侵染部位着色较深,有大量H202积累,说明组成性表达EARLI1基因能够使拟南芥在受到病原体侵染时产生超敏反应,通过局部细胞的坏死阻止病原体的扩散。所有这些结果表明,EARLI1基因在拟南芥对生物胁迫因素的防御过程中发挥着重要作用。
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