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研究背景及目的血管内皮功能受损是动脉粥样硬化(AS)发生的始动环节。NO维持血管舒张功能、抑制血小板聚集、炎性反应,在调节血管内稳态中发挥重要作用。在内皮细胞中,精氨酸酶Ⅱ (Arginase Ⅱ)可与内皮型一氧化氮合酶(eNOS)竞争其共同底物L-精氨酸,从而降低一氧化氮(NO)的生成。精氨酸酶Ⅱ是调节NO合成的重要的酶,而oxLDL可通过提高内皮细胞中精氨酸酶Ⅱ的活性从而降低内皮源性NO的生成,抑制精氨酸酶Ⅱ表达可有效的防止血管内皮功能受损及动脉粥样硬化病变的进展。但精氨酸酶Ⅱ的转录调控机制尚属未知。多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1(PARP-1)是一类DNA修复酶,可以参与炎性反应并直接关系到细胞存活,影响动脉粥样硬化的发生发展,还可发挥广泛的基因转录调节作用。我们前期质谱分析发现,多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1(PARP-1)可作为转录因子特异性结合于精氨酸酶Ⅱ启动子区域。而PARP-1能否参与调节精氨酸酶Ⅱ的活化及内皮功能尚属未知数。为此我们提出如下假设：1)抑制PARP-1可以降低内皮源性的精氨酸酶Ⅱ表达,继而影响eNOS的活性及NO的生成。2)PARP-1在调控精氨酸酶Ⅱ的表达及血管内皮功能上发挥了重要作用。基于以上思路,本研究拟用荧光素酶报告、染色质免疫共沉淀、蛋白免疫共沉淀等实验技术,研究PARP-1在调控精氨酸酶Ⅱ表达中的作用及其机制,为PARP-1通过介导精氨酸酶Ⅱ影响内皮功能提供实验依据。材料与方法1质粒构建及荧光素酶活性的检测构建pGL3载体包含不同位点的精氨酸酶Ⅱ上游启动子区域,转染HAECs,荧光素酶报告系统筛选精氨酸酶Ⅱ核心启动子区域。2细胞干预及处理不同浓度的oxLDL处理HAECs,同时转染PARP-1小干扰RNA,收取细胞蛋白及mRNA进行蛋白印迹及RT-PCR检测。3染色质免疫沉淀试验(ChIP)应用试剂盒(Millipore)进行染色质免疫沉淀(ChIP)试验。验证PARP-1是否与精氨酸酶Ⅱ启动子活性片段结合。4实时定量RT-PCRTrizol法抽提总RNA,检测PARP-1、精氨酸酶Ⅱ等mRNA水平表达。5蛋白质免疫印迹裂解液提取蛋白。SDS-PAGE电泳检测PARP-1、精氨酸酶Ⅱ、eNOS等的表达。6免疫共沉淀为探讨PARP-1与磷酸化的ERKl/2的相互作用,进行免疫共沉淀实验。7动物实验及标本检测检测ApoE-/- PARP-1+/+、ApoE-/-ARP-1-/-基因敲除小鼠血脂水平,测定主动脉组织及细胞NO含量、精氨酸酶活性,进行血管舒张试验检测内皮舒张功能。8.免疫细胞化学及免疫组织化学检测CD31、精氨酸酶Ⅱ及eNOS在HAECs及主动脉中的定位及表达。研究结果1多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1直接结合于精氨酸酶Ⅱ启动子区域-774～-738bp位点将包含不同片段的精氨酸酶Ⅱ启动子的pGL3载体转染进HAECs细胞,并检测荧光素酶活性表达,筛选出精氨酸酶Ⅱ启动子核心区域定位于-774～-738bp。染色质免疫共沉淀结果显示,应用PARP-1抗体组-774--738bp区域可见扩增条带,PARP-1特异性结合于精氨酸酶Ⅱ启动子的-774～-738bp区域。2多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1调控主动脉内皮细胞(HAECs)中精氨酸酶Ⅱ的基础转录精氨酸酶Ⅱ的mRNA与蛋白表达可分别被PARP-1小干扰RNA抑制80%及75%;同时应用PARP-1过表达载体pcDNA3.1转染到HAECs在过表达PARP-1的同时,可使精氨酸酶Ⅱ增加表达3倍左右。PARP-1作为转录因子参与精氨酸酶Ⅱ的基础转录。3氧化低密度脂蛋白在体内外均可上调多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1的表达oxLDL(50μg/ml)处理24h可使HAECs细胞中PARP-1蛋白表达较对照组提高4倍,PARP-1 mRNA水平的增高在oxLDL处理24h呈现剂量依赖性,最大效应出现在oxLDL 50μg/ml组,与对照组相比增高约3.54倍。HAECs中PARP-1 mRNA表达在50μg/ml的oxLDL刺激后0.5h即开始增加,并持续24h,表达最高水平在刺激后1小时出现,约为对照组的4倍。共聚焦显微镜观察到高胆固醇饮食喂养的小鼠主动脉内皮PARP-1表达较正常饮食的小鼠增高3倍以上。同时,发生粥样硬化的动脉较正常人主动脉其PARP-1表达也明显升高。oxLDL在体内外均能刺激PARP-1的生成。4多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1介导氧化低密度脂蛋白诱导的精氨酸酶Ⅱ表达并调节血管内皮功能高胆固醇饮食饲养的野生型小鼠主动脉精氨酸酶Ⅱ的表达较正常饮食者明显升高,但PARP-1-/-小鼠主动脉的精氨酸酶Ⅱ的表达低于野生型小鼠,且与正常饮食的野生型小鼠相比并无差异。高脂饮食饲养的野生型小鼠主动脉eNOS表达较正常饮食者明显降低,但高脂饮食下PARP-1-/-小鼠主动脉eNOS表达显著高于野生型小鼠。正常饮食的野生型小鼠主动脉NO的产生显著高于高脂饮食饲养者,而PARP-1-/-小鼠主动脉NO的产生显著高于同样接受高脂饮食饲养的野生型小鼠。同样饮食喂养情况下(正常或高胆固醇饮食),PARP-1-/-小鼠主动脉环血管舒张性都显著高于野生型小鼠。PARP-1通过调节精氨酸酶Ⅱ的生成而介导oxLDL抑制eNOS/NO表达。5氧化低密度脂蛋白通过磷酸化的ERK2与PARP-1相互作用上调精氨酸酶Ⅱ的表达PARP-1的表达在oxLDL刺激时可显著增加,而MEKl/2磷酸化的抑制剂PD98059、ERK1/2磷酸化的抑制剂U0126均可抑制PARP-1的表达。在应用抗PARP-1的抗体进行免疫沉淀所得的蛋白中可检测到磷酸化的ERK2,而且oxLDL刺激组远高于相应的对照组。蛋白印迹检测结果显示,MEKl/2磷酸化的抑制剂PD98059、ERK1/2磷酸化的抑制剂U0126以及PARP-1抑制剂DPQ处理均可显著降低精氨酸酶Ⅱ的表达。6 oxLDL增强PARP-1与肌球蛋白Myosin相互作用并调控精氨酸酶Ⅱ的表达质谱分析与PARP-1相互作用的蛋白,并用免疫共沉淀证实检测到Myosin可以与RARP-1相互作用。OxLDL刺激后HAECs肌球蛋白Myosim表达明显增多,较对照组升高4.37倍。免疫组化显示,RARP-1和肌球蛋白Myosin共定位于血管内皮,且人动脉粥样硬化的动脉比正常的动脉表达更多。小鼠体内高胆固醇饮食也可诱使主动脉肌球蛋白Myosin表达明显增多。PARP-1敲除小鼠较野生型小鼠主动脉内皮中肌球蛋白Myosin的表达明显降低。7 oxLDL通过PARP-1-myosin复合物介导染色质重塑上调精氨酸酶Ⅱ表达组蛋白2A经氧化低密度脂蛋白刺激后乙酰化增强,而PARP-1小干扰RNA处理组可促使其脱乙酰化。C9873,组蛋白乙酰转移酶抑制剂,可以抑制组蛋白2A的乙酰化进而抑制精氨酸酶Ⅱ表达,显著逆转氧化低密度脂蛋白引起的精氨酸酶Ⅱ高表达。肌球蛋白myosm抑制剂ML-7干预主动脉内皮细胞,能逆转由氧化低密度脂蛋白刺激诱导的乙酰化组蛋白H2A的高表达。肌球蛋白myosin抑制剂也可逆转由氧化低密度脂蛋白刺激诱导的内皮细胞精氨酸酶Ⅱ高表达。结论1 RARP-1可作为转录因子特异性结合于精氨酸酶Ⅱ启动子区域。2抑制RARP-1可以降低内皮源性的精氨酸酶Ⅱ表达,增加eNOS的活性及NO的生成。3 oxLDL可以通过磷酸化的ERK2向核内迁移并直接作用于PARR-1,继而活化精氨酸酶Ⅱ的转录。