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肌萎缩性脊髓侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)和额颞叶痴呆(Frontotemporal dementia, FTD)是两种渐进性且致命的神经退行性疾病,临床上没有有效的治疗方法。ALS特征性的病理表现为上、下运动神经元退变,临床表现为进行性肌肉萎缩、痉挛,构音不清,吞咽和呼吸困难。FTD是老年痴呆的第二大病因,特征性的病理表现为大脑额颞叶萎缩,临床表现为进行性人格、行为改变,认知障碍和记忆减退。ALS和FTD在临床表现,病理特征和遗传特征等方面具有重叠性。ALS越来越广泛地被认为是一种多系统损伤疾病,超过50%的患者有额颞叶功能损伤表现,如认知障碍和行为改变。与此类似的是,大约一半的FTD患者病情会发展有运动神经元损伤的症状。最近发现在许多ALS患者和FTD患者基因组中转录激活反应DNA结合蛋白-43(transactive response DNA binding protein-43, TDP-43)发生突变,并发现有TDP-43阳性包涵体在这些患者的中枢神经系统中形成。针对许多家族性ALS或FTD或ALS-FTD(指一个家族中含ALS和FTD两种患者)的遗传学研究中,发现在部分家族性患者的9号染色体短臂p21区(chromosome9p21)存在致病基因。后来,针对散发型ALS或FTD的全基因组相关性分析(Genome-wide association studies, GWAS)也发现在同样的区域存在遗传缺陷。最近,两个独立的研究小组发现,在ALS和FTD患者9号染色体开放阅读框72基因(C9ORF72)的非编码区存在大量的GGGGCC六核苷酸重复扩增。该突变导致C9ORF72转录子表达减少,以及含有GGGGCC六核苷酸重复扩增的核内RNA foci形成,并发现在家族性或散发性ALS和FTD,特别是ALS-FTD患者中,C9ORF72基因GGGGCC六核苷酸重复扩增突变是最常见的遗传病因。人类已经发现很多单基因寡核苷酸重复扩增非编码RNA (Non-coding RNA)所导致的神经遗传性疾病,如FMR1基因5’非翻译区(5’UTR)的CGG三核苷酸重复扩增引起的脆性X震颤共济失调综合征(Fragile X Tremor Ataxia Syndrome, FXTAS), DMPK基因3’非翻译区(3’UTR)的CTG三核苷酸重复扩增引起的强直性肌营养不良1型(myotonic dystrophy type1, DM1)。多数情况下,这些异常扩增的非编码RNA对基因具有调控作用,如抑制基因转录、蛋白功能丧失(loss-of-function),从而导致细胞毒性。此外,寡核苷酸重复扩增非编码RNA与RNA结合蛋白(RNA-binding proteins, RBPs)相互结合,在核内形成核酸聚集物,从而导致神经退行性病变。但是GGGGCC六核苷酸重复扩增非编码RNA (r(GGGGCC)n)与ALS/FTD发病的关系以及病理机制仍然不明。r(GGGGCC)n是否能够直接导致神经退行性变,以及通过何种机制导致神经退行性变,目前没有报道。本研究利用小鼠神经细胞模型以及转基因果蝇模型证明含有30个GGGGCC六核苷酸重复扩增的非编码RNA (r(GGGGCC)30)导致神经退行性变。r(GGGGCC)n通过富集嘌呤丰富单链DNA结合蛋白alpha (purine-rich single-stranded DNA-binding protein alpha, Pur alpha),干扰它的正常功能,从而导致神经退行性病变。1. GGGGCC六核苷酸重复扩增序列抑制下游基因转录为了研究GGGGCC六核苷酸重复扩增序列对基因表达的影响,我们分别构建了野生型((GGGGCC)3)和突变型((GGGGCC)30)六核苷酸重复序列真核细胞表达质粒。该六核苷酸重复序列位于载体pEGFP-N3的转录起始位点和翻译起始位点之间。将以上质粒瞬时转染到Neuro-2a细胞48h后,我们发现,与阴性对照组(EGFP)和野生组((GGGGCC)3-EGFP)相比,突变组((GGGGCC)30-EGFP) EGFP mRNA水平和蛋白水平均明显降低。提示GGGGCC六核苷酸重复扩增序列抑制下游基因EGFP的转录。2. GGGGCC六核苷酸重复扩增非编码RNA介导神经退行性病变为了研究GGGGCC六核苷酸重复扩增非编码RNA是否导致神经退行性变,我们构建了能够表达野生型和突变型r(GGGGCC)n的Neuro-2a细胞模型。用Cell-Titer Blue Assay法检测转染后48h各组细胞活力发现,与阴性对照组和野生组相比,突变组细胞活力明显下降。免疫荧光染色发现,突变组细胞胞质内形成大量泛素阳性包涵体(inclusion),而阴性对照组和野生组不见或少见泛素阳性包涵体。以上表明,r(GGGGCC)n导致Neuro-2a细胞退行性变。为了进一步在体内证实r(GGGGCC)n介导神经退变,我们构建了能够表达野生型和突变型r(GGGGCC)n的转基因果蝇模型。与哺乳动物表达载体pEGFP-N3类似,我们将GGGGCC六核苷酸重复序列克隆到果蝇转基因载体pUAST-EGFP的转录起始位点和翻译起始位点之间。用GAL4/UAS (upstream activator sequence)系统控制目的基因(GGGGCC)n-EGFP在果蝇特异性的神经组织表达。Gmr-GAL4可以调控目的基因在果蝇复眼神经细胞表达。我们发现突变组(Gmr-GAL4/UAS-(GGGGCC)30-EGFP)转基因果蝇复眼明显破坏,形成黑色坏死斑,色素沉着减少。此外,我们观察了5个不同时间点(Day1, Day7, Day14, Day21和Day28)各组转基因果蝇在发病过程中的表型变化：随着年龄增长,突变组转基因果蝇复眼呈进行性破坏,而阴性对照组(Gmr-GAL4/w1118)转基因果蝇和野生组(Gmr-GAL4/UAS-(GGGGCC)3-EGFP)转基因果蝇复眼形态正常。OK371-GAL4可以调控目的基因在果蝇的运动神经元表达。我们利用果蝇活动监测系统(Drosophila Activity Monitor System)观察各组转基因果蝇的运动活力随时间的变化：在羽化成虫后第7天(Day7),各组转基因果蝇运动活力没有明显差别,但在羽化成虫后第28天(Day28),与阴性对照组(OK371-GAL4/w1118)和野生组(OK371-GAL4/UAS-(GGGGCC)3-EGFP)转基因果蝇相比,突变组(OK371-GAL4/UAS-(GGGGCC)30-EGFP)转基因果蝇运动活力明显降低。这些结果表明,r(GGGGCC)n可以介导转基因果蝇进行性神经退变。3. GGGGCC六核苷酸重复扩增非编码RNA与Pur alpha相互作用很多寡核苷酸重复扩增非编码RNA通过富集RBPs介导神经退行性疾病。我们推测r(GGGGCC)n也有类似的作用。分离和鉴定r(GGGGCC)n特异性的RBPs是了解其介导神经退行性病变分子机制的关键因素。利用人工合成的带有生物素标记的rGGGGCC重复序列RNA探针与小鼠脊髓匀浆蛋白共孵育,用链霉亲和素包被的磁珠分离和纯化RNA结合蛋白。经过质谱鉴定和蛋白质组学分析,发现了100余种RNA结合蛋白,其中转录激活蛋白Pur alpha含量最多。为了验证r(GGGGCC)n与RBPs结合的特异性,用未标记的rGGGGCC和rCGG重复序列RNA探针进行体外竞争性结合实验。结果显示,未标记的rGGGGCC和rCGG重复序列RNA探针能够显著抑制生物素标记的rGGGGCC重复序列RNA探针与RBPs结合。为了验证r(GGGGCC)n与Pur alpha结合的特异性,我们构建了GST融合蛋白GST-Pur alpha(小鼠和果蝇)。用32P标记的rGGGGCC重复序列RNA探针与纯化的GST融合蛋白进行的RNA-蛋白结合实验发现,小鼠和果蝇Pur alpha能够以剂量依赖的方式与RNA探针特异性结合,而GST和GST-hnRNP A2/B1与RNA探针没有特异性结合。此外,我们用Western blot技术检测发现rGGGGCC重复序列探针RNA与人和小鼠Pur alpha结合,而不与人和小鼠TDP-43结合。以上结果表明,Pur alpha与r(GGGGCC)n特异性结合,并且在人,小鼠和果蝇之间具有保守性。为了证实Pur alpha是否与r(GGGGCC)n在体内结合,我们利用Neuro-2a细胞进行了RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA immunoprecipitation, RIP)实验。结果显示,免疫沉淀的(GGGGCC)30-EGFP RNA水平明显高于EGFP组和(GGGGCC)3-EGFP组,表明Pur-alpha与r(GGGGCC)n在体内相互作用。4. Pur alpha抑制GGGGCC六核苷酸重复扩增非编码RNA介导的神经退行性变为了研究Pur alpha对r(GGGGCC)n介导的神经退行性变的影响,在Neuro-2a细胞中过表达Pur alpha,比较共转染48h后阴性对照组,野生组和突变组细胞活力。结果表明,过表达Pur alpha能够明显改善突变组Neuro-2a细胞活力,干扰Pur alpha表达后Neuro-2a细胞活力明显降低。同时,我们将突变型转基因果蝇与Pur alpha转基因果蝇杂交,发现其子代转基因果蝇(Gmr-GAL4/UAS-(GGGGCC)30-EGFP; UAS-Pur alpha)复眼形态结构明显改善,色素增加。由此表明Pur alpha能够抑制r(GGGGCC)n介导的果蝇神经退变。综上所述,r(GGGGCC)n通过富集RNA结合蛋白Pur alpha,干扰其正常功能,从而导致神经退行性病变。