背景食管癌是我国较常见的恶性肿瘤,在世界范围内,属第六大最常见的癌症,癌症死亡的第五大原因,主要分为两大亚型:食管鳞状细胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC)和食管腺癌(Esophageal Adenocarcinoma,EAC),西方国家食管癌以EAC为主,而ESCC在发展中国家较为普遍。目前对食管癌的治疗仍以手术切除,辅以放化疗的方法。受检测方法等因素限制,多数患者发现时已属中晚期,传统的治疗方法不能有效延长患者的生存期,因此从基因和分子水平探讨食管癌发生发展机制,显得尤为必要和迫切。Micro RNAs(mi RNAs)是一类大小约20-24 nt的非编码微小RNA,在生物中广泛存在,并通过与靶标基因m RNA上的3’端非翻译区(3’untranslational region,3’-UTR)种子区域特异结合对靶基因实现转录后调控,或者维持靶基因的稳定性。近年来的研究显示,mi RNA通过与靶基因的3’-UTR结合从而抑制特定的癌基因或抑癌基因,其作用类似抑癌基因或癌基因,参与肿瘤细胞的生成、转移、侵润及上皮间质化转化等多种生物学过程,在肿瘤的发生发展中起着重要作用,目前mi RNA在肿瘤中的研究己成为一个新热点。mi RNA在转录后水平对基因表达的调控是21世纪的一个里程碑似的科学发现。多项研究证实mi RNAs在食管癌中的重要性和潜在应用前景,多个抑制或促进食管癌进程的mi RNAs被发现,如mi R-21、mi R-205、mi R-203、mi R-145、let7、mi R-196a等。mi R-1207-5p位于染色体8q24,由非编码基因PVT1产生,与其同家族的还有mi R-1204、mi R-1205、mi R-1206和mi R-1208,PVT1是多种类型癌症的一个潜在的致癌基因。该家族的mi R-1204和mi R-1206均发现在肿瘤发生发展中的作用。在包括乳腺癌、胃癌和肠癌多种肿瘤以及干燥综合征、慢性肾衰竭等疾病中发现mi R-1207-5p异常表达并与疾病的恶性程度密切相关,然而它在食管癌中的表达和作用尚未有研究报道。本课题主要包括:1.探讨mi R-1207-5p在食管鳞癌组织及细胞中的表达,以及与疾病的相关性;2.调控mi R-1207-5p表达水平对食管鳞癌细胞株EC9706和EC-1的生物学影响;3.初步探讨mi R-1207-5p靶基因及抑制肿瘤的可能机制。研究目的在于探讨mi R-1207-5p对食管鳞癌发生发展的影响,以期为食管鳞癌的诊断和防治提供理论依据。材料与方法第一部分mi R-1207-5p在食管鳞癌组织中的异常表达及其与临床病理特征相关性1收集49例ESCC临床标本及其匹配的癌旁组织。2取3例ESCC中心组织及其匹配癌旁组织行Agilent mi RNA芯片检测,分析mi RNA的差异性表达,筛选出上调或下调的mi RNA。3 TRIzol法提取组织总RNA并检测RNA质量;q RT-PCR法分别验证上调的mi RNA 3个(mi R-21-5p,mi R-138和mi R-196a-5p);下调的mi RNA 3个(mi R-133a,mi R-495和mi R-1207-5p);4根据mi R-1207-5p在组织中的表达水平,分析mi R-1207-5p表达水平与患者的临床分期、淋巴结转移与否、肿瘤定位、性别和年龄等之间的关系。5检测5种鳞癌细胞株和正常食管上皮细胞中mi R-1207-5p的表达水平。第二部分mi R-1207-5p对食管鳞癌细胞生物学行为的影响1合成mi R-1207-5p模拟物(mimics)和对应的阴性对照(NC)后,通过脂质体LipofectamineTM2000瞬时转染鳞癌细胞株EC9706和EC-1。2应用CCK-8(Cell Counting Kit-8)实验检测转染后细胞的增殖变化。3 Transwell侵袭实验观察转染后细胞的侵袭力。4 Annexin V-FITC/PI法和Hoechst33342/PI检测细胞凋亡。PI染色检测细胞周期变化。5合成经修饰过的mi R-1207-5p模拟物(agomir)和对应的NC后,通过脂质体LipofectamineTM2000转染鳞癌细胞EC9706,接种裸鼠皮下,检测mi R-1207-5p在体内对肿瘤生长的影响。第三部分mi R-1207-5p与STOML-2的靶向关系研究1通过Target Scan(www.targetscan.org)和mi RDB(www.mirdb.org)在线预测mi R-1207-5p的靶基因,STOML-2(Stomatin-like protein 2)为其潜在靶基因。2检测49例鳞癌中心组织及其匹配癌旁组织的STOML-2 m RNA和蛋白表达水平,并与mi R-1207-5p在组织中的表达水平进行相关性分析。3检测5种鳞癌细胞中的STOML-2蛋白水平。4通过双荧光素酶报告基因实验验证靶基因。将STOML-2 3’-UTR的野生型(WT)和突变型(MT)序列插入pmir GLO载体构建荧光素酶报告基因重组质粒pmir GLO-STOML-2-3’-UTR-WT/MT;然后将其与mi R-1207-5p mimics或NC共转染HEK293T细胞,分别检测各组细胞荧光素酶活性;以验证STOML-2是否为mi R-1207-5p的靶基因。5将mi R-1207-5p mimics或NC转染食管鳞癌细胞株EC9706和EC-1,WB检测细胞内STOML-2蛋白表达情况。6运用小RNA干扰技术降低鳞癌细胞中STOML-2的表达,同时构建缺失3’-UTR的表达真核表达载体pc DNA3.1-STOML-2上调鳞癌细胞中STOML-2的表达,观察其表达对细胞增殖和侵袭的影响;在细胞中利用表达载体pc DNA3.1-STOML-2上调STOML-2表达,同时在细胞中共转染mi R-1207-5p mimics或NC,观察细胞增殖和侵袭的变化,并分析STOML-2是否阻断mi R-1207-5p对细胞增殖和侵袭力的抑制作用。7统计学分析:采用SPSS21.0统计软件对实验数据进行,数据以X±s表示,组间比较采用t检验和ANOVA。以P<0.05为差异有统计学意义。相关性检验用Spearman分析,以α=0.05为显著性水准。结果第一部分mi R-1207-5p在食管鳞癌组织中的异常表达及其与临床病理特征相关性1在检测的3例鳞癌中心组织中,芯片筛选出上调表达的mi RNAs 18个,下调表达的mi RNAs 40个。2经q RT-PCR验证的6个mi RNAs(mi R-21-5p,mi R-138,mi R-196a-5p,mi R-133a,mi R-495和mi R-1207-5p),表达均与芯片结果一致,其中mi R-1207-5p为下调表达。3 49例食管鳞癌中心组织与其匹配癌旁组织中,81.6%(40/49)的鳞癌患者肿瘤组织中mi R-1207-5p表达水平较癌旁对照组织降低;差异具有统计学意义(P<0.05);统计分析表明:mi R-1207-5p表达水平下降与肿瘤分化程度有相关性(P<0.01);与淋巴结转移和分期均有相关性(P<0.01)。但与肿瘤定位、性别和年龄无关(P>0.05)。4 5种鳞癌细胞中mi R-1207-5p的水平较正常上皮细胞低(P<0.05)。第二部分mi R-1207-5p对食管鳞癌细胞生物学行为的影响1转染mi R-1207-5p mimics至食管鳞癌细胞株EC9706和EC-1后,与对照组比较,EC9706细胞内mi R-1207-5p表达水平为34.20±3.86,EC-1细胞内mi R-1207-5p表达水平为18.81±3.17,表达水平上调,差异显著(P<0.01)2与转染mi R-1207-5p NC组相比,mi R-1207-5p mimics组细胞增殖率在48h后出现显著抑制(P<0.05);3转染mi R-1207-5p mimics后,EC9706和EC-1两种细胞穿过基质膜的数量分别为43.6±6.19和39.2±4.70,与对照组比较显著降低(P<0.05)。4在转染mi R-1207-5p mimics的细胞中,EC9706细胞凋亡率为(11.33±1.01)%,NC组为(6.31±0.54)%,P<0.05;EC-1细胞凋亡率为(7.92±0.98)%,NC组为(4.88±0.53)%,P<0.05。5 Blank、NC和mi R-1207-5p mimics各转染组中,G0/G1期细胞比例在EC9706细胞中分别为54.84%,54.15%和66.85%;在EC-1细胞中分别为56.29%,55.96%和67.14%,mi R-1207-5p mimics组细胞G0/G1期细胞比例显著增高,差异具有显著性(P<0.05);而S期细胞比例减少(EC9706:29.44%,31.15%和21.60%;EC-1:31.21%,32.14%和17.16%)。6裸鼠成瘤实验显示:mi R-1207-5p agomir组肿瘤体积显著低于mi R-1207-5p对照组肿瘤体积(P<0.05),并且肿瘤生长速度减缓。第三部分mi R-1207-5p与STOML-2的靶向关系研究1 Target Scan和mi RDB均预测STOML-2为mi R-1207-5p的靶基因之一。2检测49例食管鳞癌中心组织与其匹配癌旁组织,发现STOML-2 m RNA和蛋白在癌组织中均表达升高,而mi R-1207-5p在癌组织中表达水平降低,相关性分析表明:mi R-1207-5p和STOML-2在组织中存在负相关(R2=0.73)。3 5种鳞癌细胞株中STOML-2蛋白表达高于正常食管上皮细胞。4共转染mi R-1207-5p mimics和pmir GLO-STOML-2-3’-UTR-WT重组载体时,细胞萤光素酶基因活性显著降低(P<0.01);而同时转染mi R-1207-5p mimics和pmir GLO-STOML-2-3’-UTR-MT重组载体时,细胞萤光素酶基因活性无显著变化。5在EC9706和EC-1细胞中,WB结果显示:与对照组相比,转染mi R-1207-5p mimics的细胞中,STOML-2蛋白表达水平显著抑制(P<0.05);提示mi R-1207-5p mimics可以与STOML-2的3’-UTR结合并抑制其表达,进一步验证STOML-2为mi R-1207-5p的靶基因。6在EC9706和EC-1细胞中,运用RNAi技术降低STOML-2的表达后,与对照组相比,细胞增殖和侵袭力显著降低(P<0.05)。7在EC9706和EC-1细胞中,转染无3’-UTR的pc DNA3.1-STOML-2表达载体组,STOML-2蛋白表达水平与未转染组比较,显著升高。细胞侵袭实验表明:与对照组比较,该组细胞穿过基质膜的细胞数明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);与共转染mi R-1207-5p mimics和无3’-UTR的pc DNA3.1-STOML-2组比较,该转染组细胞穿过基底膜的细胞数量无显著性改变(P>0.05)。结果显示:mi R-1207-5p是通过结合STOML-2基因的3’-UTR而调控其表达的;上调STOML-2表达可部分逆转mi R-1207-5p对鳞癌细胞侵袭的抑制作用。结论1食管鳞癌组织中共筛选获得18个上调表达的mi RNAs,40个下调表达的mi RNAs。mi R-1207-5p在食管鳞癌组织中低表达,并且mi R-1207-5p的表达水平与患者的淋巴结转移、肿瘤进程和TNM分期相关。2上调mi R-1207-5p表达能够对细胞增殖和侵袭起抑制作用,而对细胞的凋亡则起促进作用;mi R-1207-5p过表达能够减缓肿瘤生长速度,缩小肿瘤体积。3 STOML-2为mi R-1207-5p的靶基因,mi R-1207-5p可通过结合STOML-2的3’-UTR而调节其蛋白表达进而调控食管鳞癌细胞生物学性状。在组织中二者存在负相关关系。4 si RNA干扰STOML-2表达后,鳞癌细胞增殖和侵袭力降低。