本研究利用CRISPR/Cas9的基因编辑技术建立了火鸡疱疹病毒的载体平台,并拯救获得在US2或US10基因内表达外源基因的重组火鸡疱疹病毒。首先根据HVT FC-126毒株US2基因序列,设计并合成g RNA,并通过双链退火的方式,获得目的片段。目的片段与Bbs1酶切处理后的px330载体连接,获得重组质粒px330-gRNA。通过PCR的方法,分别扩增获得US2的g RNA序列两侧的同源臂A(US2A)和B(US2B)及EGFP编码蛋白的序列,并通过PCR的方法,扩增获得US2A-EGFP-US2B片段。将px330-g RNA和US2A-EGFP-US2B电转入鸡胚成纤维细胞。24h后,将电转的细胞感染HVT FC-126。感染后72h,收集较大荧光簇的细胞。进一步地将收集的细胞团稀释成一定的浓度并接种于新的鸡胚成纤维细胞。通过蚀斑纯化的方法,最终获得了稳定表达EGFP的重组病毒rHVT-US2-EGFP。用同样的方法,也获得了稳定表达EGFP的重组病毒rHVT-US10-EGFP。这些研究结果建立了HVT重组表达载体系统,为后期的拯救稳定表达外源蛋白HVT重组病毒及其应用研究奠定基础。