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背景：
我国高原面积广阔，是重要的战略地域。低氧作为高原地区主要的环境特征，是限制人们生活、工作的重要因素。低氧环境暴露可导致人体多个系统功能发生改变，其中中枢神经系统对缺氧最为敏感。长期暴露于高原环境，认知功能发生减退，其具体机制尚不清楚。因此，研究低氧暴露导致认知功能障碍的机制对于保护高原人群健康具有重要的现实意义。
突触结构可塑性活动是低氧影响认知功能的重要机制，树突棘是神经元树突上的突起结构，其结构和形态具有高度的可塑性，对维持正常的学习记忆功能至关重要。目前，从突触结构可塑性角度探讨低氧暴露对认知功能损伤机制的研究较少。围绕树突棘形态结构阐述低氧影响学习记忆损伤机制可能是一个新的突破口。
冷诱导RNA结合蛋白(Cold-inducible RNA-binding Protein，CIRBP)作为一种环境应激蛋白，其表达水平受到低温、紫外线等环境因素的影响。CIRBP在人和动物体内参与神经系统发育、胚胎发育、昼夜节律等多种生理功能。本课题组前期研究表明：CIRBP对低氧暴露下神经干细胞的增殖有促进作用，说明CIRBP可能参与低氧暴露时的神经保护机制。本课题将从神经行为学、组织及细胞形态学和分子生物学等多角度观察低氧对小鼠学习记忆功能及树突棘可塑性的影响，探讨CIRBP分子在低氧导致小鼠学习记忆损伤中的作用及其可能机制，为研究低氧暴露导致学习记忆功能损伤的分子机制提供新的视角。
目的：
本研究通过建立小鼠低氧暴露模型，原代海马神经元低氧暴露模型以及HT22小鼠海马神经元低氧暴露模型，观察低氧暴露对小鼠学习记忆功能、海马神经元树突棘形态以及CIRBP表达水平的影响，并通过干预CIRBP分子表达，验证CIRBP在低氧影响小鼠学习记忆功能以及海马神经元树突棘形态变化中的作用，初步探讨其可能的分子机制。
方法：
1.建立低氧暴露模型：
1)小鼠低氧暴露模型：以C57BL/6雄性小鼠为研究对象，利用本教研室低压低氧复合实验舱，连续暴露14天(14d)，设置海拔高度为6000m。
2)原代海马神经元低氧暴露模型：原代培养小鼠海马神经元生长14d后在DWS-H85低氧工作站内培养24h，暴露氧浓度为1%。
3)HT22小鼠海马神经元低氧暴露模型：HT22小鼠海马神经元正常培养、传代，置于DWS-H85低氧工作站培养24h，暴露氧浓度为1%。
2.采用水迷宫实验、新物体识别实验、回避平台实验等神经行为学技术检测小鼠学习记忆能力。
3.采用高尔基染色法观察小鼠海马神经元树突棘形态改变。
4.采用慢病毒感染方法，在共聚焦显微镜下观察原代海马神经元树突棘形态的改变。
5.采用Western-blot方法检测组织及细胞中相应蛋白的表达水平。
6.采用实时定量PCR实验方法检测组织及细胞中相应mRNA的表达水平。
7.通过脑立体定位注射AAV腺相关病毒技术，建立脑海马区高表达CIRBP或PSD95动物模型。
8.采用质粒转染和病毒感染技术，建立体外高表达CIRBP及PSD95细胞模型。
9.采用组织荧光染色观察AAV病毒在小鼠海马CA1区的特异性表达。
10.通过荧光素酶报告实验检测CIRBP与PSD953’-UTR区的相互作用。
11.通过RNA结合蛋白免疫沉淀技术联合高通量测序检测与CIRBP蛋白结合的RNA分子，并进行生物信息学分析。
结果：
1.低氧暴露对小鼠学习记忆功能及海马神经元树突棘形态的影响
1)低氧暴露导致小鼠学习记忆功能下降
水迷宫实验结果表明，与常氧组相比，低氧组小鼠到达平台潜伏期时间增加(P＜0.05)。新物体识别实验结果表明，与常氧组相比，低氧组小鼠对新物体的探索时间以及鉴别指数显著降低(P＜0.05)。回避离开平台实验表明，与常氧组相比，小鼠离开平台潜伏期显著缩短(P＜0.01)。
2)低氧暴露导致小鼠海马神经元树突棘形态异常
高尔基染色结果显示，与常氧组相比，低氧暴露后小鼠海马CA1区树突棘分支无显著改变(P＞0.05)，而基树突和顶树突的树突棘密度明显降低(P＜0.01)，树突棘长度增加(P＜0.01)。在小鼠原代海马神经元低氧暴露模型中，树突棘密度降低(P＜0.01)。
3)低氧暴露影响PSD95蛋白表达
Western-blot实验结果表明，与常氧组相比，低氧暴露后小鼠海马组织、小鼠原代海马神经元、HT22细胞中PSD95蛋白表达降低(P＜0.05)。实时定量PCR实验结果表明，与常氧组相比，低氧暴露后小鼠海马组织、小鼠原代海马神经元、HT22细胞中PSD95mRNA表达均无明显改变(P＞0.05)。
2.CIRBP在低氧影响学习记忆功能和导致树突棘可塑性损伤中的作用
1)低氧暴露影响CIRBP蛋白表达
Western-blot实验结果表明，与常氧组相比，低氧暴露后小鼠海马组织、小鼠原代海马神经元、HT22细胞中CIRBP蛋白表达降低(P＜0.05)。实时定量PCR实验结果表明，与常氧组相比，低氧暴露后小鼠海马组织、小鼠原代海马神经元、HT22细胞中CIRBPmRNA表达无明显变化(P＞0.05)。
2)高表达CIRBP缓解低氧暴露导致的小鼠学习记忆功能损伤
通过脑立体定位技术在海马CA1区注射AAV-CIRBP病毒，荧光染色和Western-blot方法确定高表达CIRBP模型建立成功。水迷宫实验结果显示，低氧暴露后，高表达CIRBP组(AAV-CIRBP)相较于对照组(AAV-NC)小鼠到达平台潜伏期时间缩短(P＜0.05)。新物体识别实验结果显示，低氧暴露后，AAV-CIRBP组相较于AAV-NC组小鼠对新物体识别的时间有所增加，鉴别指数上升(P＜0.05)。回避离开平台实验结果显示，低氧暴露后，AAV-CIRBP组相较于AAV-NC组小鼠离开平台潜伏期的时间延长(P＜0.05)。
3)高表达CIRBP使低氧暴露后小鼠海马神经元树突棘形态损伤有所恢复
高尔基染色结果显示，高表达CIRBP后小鼠海马CA1区树突棘分支无显著变化(P＞0.05)；而基树突和顶树突的树突棘密度有所增加，树突棘长度降低(P＜0.05)。利用病毒感染技术建立原代海马神经元高表达CIRBP模型，低氧暴露后，高表达CIRBP组相较于对照组树突棘密度回调(P＜0.05)。
3.CIRBP影响低氧暴露导致树突棘可塑性异常的可能机制
1)高表达CIRBP使低氧暴露后PSD95蛋白表达有所恢复
Western-blot实验结果表明，在小鼠海马组织、小鼠原代海马神经元、HT22细胞中，低氧暴露后，高表达CIRBP后相较于对照组，PSD95蛋白表达显著回调(P＜0.05)。实时定量PCR实验结果表明，低氧暴露后，高表达CIRBP组相较于对照组PSD95mRNA水平无显著变化(P＞0.05)。
2)高表达PSD95缓解低氧暴露导致的小鼠学习记忆功能损伤
在小鼠海马CA1区注射AAV-PSD95病毒，通过荧光显微镜观察和Western-blot实验确定高表达PSD95模型建立成功。水迷宫实验结果显示，低氧暴露后，高表达PSD95组相较于对照组小鼠到达平台潜伏期的时间显著缩短(P＜0.01)，在目标象限的停留时间以及穿越平台的频率显著增加(P＜0.05)。回避离开平台实验结果显示，低氧暴露后，高表达PSD95组相较于对照组小鼠到达平台潜伏期的时间延长(P＜0.05)。
3)高表达PSD95使低氧暴露后小鼠海马神经元树突棘形态损伤有所恢复
高尔基染色结果显示，低氧暴露后，高表达PSD95组相较于对照组小鼠海马顶树突树突棘密度回升(P＜0.05)。
4)CIRBP与PSD953’UTR区无直接调控作用
荧光素酶报告系统实验结果表明，CIRBP与PSD953’UTR区无结合作用，荧光素酶活性无明显变化(P＞0.05)。
结论：
1.低氧暴露可损害小鼠学习记忆功能，影响海马神经元树突棘的正常形态。
2.低氧暴露可抑制CIRBP表达，高表达CIRBP可改善低氧导致的学习记忆功能损伤，并使低氧暴露后海马神经元树突棘形态损伤有所恢复。
3.高表达PSD95可改善低氧导致的学习记忆损伤和树突棘形态改变；CIRBP蛋白与PSD95mRNA可能不存在相互结合，CIRBP通过某种间接调控机制影响低氧暴露后PSD95的表达。
我国高原面积广阔，是重要的战略地域。低氧作为高原地区主要的环境特征，是限制人们生活、工作的重要因素。低氧环境暴露可导致人体多个系统功能发生改变，其中中枢神经系统对缺氧最为敏感。长期暴露于高原环境，认知功能发生减退，其具体机制尚不清楚。因此，研究低氧暴露导致认知功能障碍的机制对于保护高原人群健康具有重要的现实意义。
突触结构可塑性活动是低氧影响认知功能的重要机制，树突棘是神经元树突上的突起结构，其结构和形态具有高度的可塑性，对维持正常的学习记忆功能至关重要。目前，从突触结构可塑性角度探讨低氧暴露对认知功能损伤机制的研究较少。围绕树突棘形态结构阐述低氧影响学习记忆损伤机制可能是一个新的突破口。
冷诱导RNA结合蛋白(Cold-inducible RNA-binding Protein，CIRBP)作为一种环境应激蛋白，其表达水平受到低温、紫外线等环境因素的影响。CIRBP在人和动物体内参与神经系统发育、胚胎发育、昼夜节律等多种生理功能。本课题组前期研究表明：CIRBP对低氧暴露下神经干细胞的增殖有促进作用，说明CIRBP可能参与低氧暴露时的神经保护机制。本课题将从神经行为学、组织及细胞形态学和分子生物学等多角度观察低氧对小鼠学习记忆功能及树突棘可塑性的影响，探讨CIRBP分子在低氧导致小鼠学习记忆损伤中的作用及其可能机制，为研究低氧暴露导致学习记忆功能损伤的分子机制提供新的视角。
目的：
本研究通过建立小鼠低氧暴露模型，原代海马神经元低氧暴露模型以及HT22小鼠海马神经元低氧暴露模型，观察低氧暴露对小鼠学习记忆功能、海马神经元树突棘形态以及CIRBP表达水平的影响，并通过干预CIRBP分子表达，验证CIRBP在低氧影响小鼠学习记忆功能以及海马神经元树突棘形态变化中的作用，初步探讨其可能的分子机制。
方法：
1.建立低氧暴露模型：
1)小鼠低氧暴露模型：以C57BL/6雄性小鼠为研究对象，利用本教研室低压低氧复合实验舱，连续暴露14天(14d)，设置海拔高度为6000m。
2)原代海马神经元低氧暴露模型：原代培养小鼠海马神经元生长14d后在DWS-H85低氧工作站内培养24h，暴露氧浓度为1%。
3)HT22小鼠海马神经元低氧暴露模型：HT22小鼠海马神经元正常培养、传代，置于DWS-H85低氧工作站培养24h，暴露氧浓度为1%。
2.采用水迷宫实验、新物体识别实验、回避平台实验等神经行为学技术检测小鼠学习记忆能力。
3.采用高尔基染色法观察小鼠海马神经元树突棘形态改变。
4.采用慢病毒感染方法，在共聚焦显微镜下观察原代海马神经元树突棘形态的改变。
5.采用Western-blot方法检测组织及细胞中相应蛋白的表达水平。
6.采用实时定量PCR实验方法检测组织及细胞中相应mRNA的表达水平。
7.通过脑立体定位注射AAV腺相关病毒技术，建立脑海马区高表达CIRBP或PSD95动物模型。
8.采用质粒转染和病毒感染技术，建立体外高表达CIRBP及PSD95细胞模型。
9.采用组织荧光染色观察AAV病毒在小鼠海马CA1区的特异性表达。
10.通过荧光素酶报告实验检测CIRBP与PSD953’-UTR区的相互作用。
11.通过RNA结合蛋白免疫沉淀技术联合高通量测序检测与CIRBP蛋白结合的RNA分子，并进行生物信息学分析。
结果：
1.低氧暴露对小鼠学习记忆功能及海马神经元树突棘形态的影响
1)低氧暴露导致小鼠学习记忆功能下降
水迷宫实验结果表明，与常氧组相比，低氧组小鼠到达平台潜伏期时间增加(P＜0.05)。新物体识别实验结果表明，与常氧组相比，低氧组小鼠对新物体的探索时间以及鉴别指数显著降低(P＜0.05)。回避离开平台实验表明，与常氧组相比，小鼠离开平台潜伏期显著缩短(P＜0.01)。
2)低氧暴露导致小鼠海马神经元树突棘形态异常
高尔基染色结果显示，与常氧组相比，低氧暴露后小鼠海马CA1区树突棘分支无显著改变(P＞0.05)，而基树突和顶树突的树突棘密度明显降低(P＜0.01)，树突棘长度增加(P＜0.01)。在小鼠原代海马神经元低氧暴露模型中，树突棘密度降低(P＜0.01)。
3)低氧暴露影响PSD95蛋白表达
Western-blot实验结果表明，与常氧组相比，低氧暴露后小鼠海马组织、小鼠原代海马神经元、HT22细胞中PSD95蛋白表达降低(P＜0.05)。实时定量PCR实验结果表明，与常氧组相比，低氧暴露后小鼠海马组织、小鼠原代海马神经元、HT22细胞中PSD95mRNA表达均无明显改变(P＞0.05)。
2.CIRBP在低氧影响学习记忆功能和导致树突棘可塑性损伤中的作用
1)低氧暴露影响CIRBP蛋白表达
Western-blot实验结果表明，与常氧组相比，低氧暴露后小鼠海马组织、小鼠原代海马神经元、HT22细胞中CIRBP蛋白表达降低(P＜0.05)。实时定量PCR实验结果表明，与常氧组相比，低氧暴露后小鼠海马组织、小鼠原代海马神经元、HT22细胞中CIRBPmRNA表达无明显变化(P＞0.05)。
2)高表达CIRBP缓解低氧暴露导致的小鼠学习记忆功能损伤
通过脑立体定位技术在海马CA1区注射AAV-CIRBP病毒，荧光染色和Western-blot方法确定高表达CIRBP模型建立成功。水迷宫实验结果显示，低氧暴露后，高表达CIRBP组(AAV-CIRBP)相较于对照组(AAV-NC)小鼠到达平台潜伏期时间缩短(P＜0.05)。新物体识别实验结果显示，低氧暴露后，AAV-CIRBP组相较于AAV-NC组小鼠对新物体识别的时间有所增加，鉴别指数上升(P＜0.05)。回避离开平台实验结果显示，低氧暴露后，AAV-CIRBP组相较于AAV-NC组小鼠离开平台潜伏期的时间延长(P＜0.05)。
3)高表达CIRBP使低氧暴露后小鼠海马神经元树突棘形态损伤有所恢复
高尔基染色结果显示，高表达CIRBP后小鼠海马CA1区树突棘分支无显著变化(P＞0.05)；而基树突和顶树突的树突棘密度有所增加，树突棘长度降低(P＜0.05)。利用病毒感染技术建立原代海马神经元高表达CIRBP模型，低氧暴露后，高表达CIRBP组相较于对照组树突棘密度回调(P＜0.05)。
3.CIRBP影响低氧暴露导致树突棘可塑性异常的可能机制
1)高表达CIRBP使低氧暴露后PSD95蛋白表达有所恢复
Western-blot实验结果表明，在小鼠海马组织、小鼠原代海马神经元、HT22细胞中，低氧暴露后，高表达CIRBP后相较于对照组，PSD95蛋白表达显著回调(P＜0.05)。实时定量PCR实验结果表明，低氧暴露后，高表达CIRBP组相较于对照组PSD95mRNA水平无显著变化(P＞0.05)。
2)高表达PSD95缓解低氧暴露导致的小鼠学习记忆功能损伤
在小鼠海马CA1区注射AAV-PSD95病毒，通过荧光显微镜观察和Western-blot实验确定高表达PSD95模型建立成功。水迷宫实验结果显示，低氧暴露后，高表达PSD95组相较于对照组小鼠到达平台潜伏期的时间显著缩短(P＜0.01)，在目标象限的停留时间以及穿越平台的频率显著增加(P＜0.05)。回避离开平台实验结果显示，低氧暴露后，高表达PSD95组相较于对照组小鼠到达平台潜伏期的时间延长(P＜0.05)。
3)高表达PSD95使低氧暴露后小鼠海马神经元树突棘形态损伤有所恢复
高尔基染色结果显示，低氧暴露后，高表达PSD95组相较于对照组小鼠海马顶树突树突棘密度回升(P＜0.05)。
4)CIRBP与PSD953’UTR区无直接调控作用
荧光素酶报告系统实验结果表明，CIRBP与PSD953’UTR区无结合作用，荧光素酶活性无明显变化(P＞0.05)。
结论：
1.低氧暴露可损害小鼠学习记忆功能，影响海马神经元树突棘的正常形态。
2.低氧暴露可抑制CIRBP表达，高表达CIRBP可改善低氧导致的学习记忆功能损伤，并使低氧暴露后海马神经元树突棘形态损伤有所恢复。
3.高表达PSD95可改善低氧导致的学习记忆损伤和树突棘形态改变；CIRBP蛋白与PSD95mRNA可能不存在相互结合，CIRBP通过某种间接调控机制影响低氧暴露后PSD95的表达。