【摘 要】
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精氨酸酶（Arginase,ARG）是一种锰金属酶,它催化尿素循环的最后一步,将L-精氨酸（L-arginine）分解为L-鸟氨酸（L-ornithine）和尿素（urea）。ARG包含精氨酸酶1（ARG1）和精氨酸酶2（ARG2）两种亚型,哺乳动物中ARG1定位在胞质中,ARG2则是定位在线粒体中。近年来ARG被发现与心血管系统、肾脏和中枢神经系统的功能障碍和病理相关,并被证明在炎症引发的免疫功
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精氨酸酶（Arginase,ARG）是一种锰金属酶,它催化尿素循环的最后一步,将L-精氨酸（L-arginine）分解为L-鸟氨酸（L-ornithine）和尿素（urea）。ARG包含精氨酸酶1（ARG1）和精氨酸酶2（ARG2）两种亚型,哺乳动物中ARG1定位在胞质中,ARG2则是定位在线粒体中。近年来ARG被发现与心血管系统、肾脏和中枢神经系统的功能障碍和病理相关,并被证明在炎症引发的免疫功能障碍和免疫抑制等中发挥功能。尽管哺乳动物ARG的功能已有相当深入研究,但硬骨鱼ARG的功能地位还未明确。本论文以草鱼（Grass carp）为模型,分离鉴定其ARG,阐明了它与诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）的竞争关系,并发现ARG通过该竞争关系在NO（nitric oxide）引起的细胞损伤中发挥作用,具体研究内容如下:首先克隆获取草鱼ARG1和ARG2的编码序列（Coding sequence,CDS）,草鱼ARG1的CDS长度为1014bp,编码337个氨基酸;草鱼ARG2的CDS长度为1041bp,可编码346个氨基酸。序列分析结果显示草鱼ARG1和ARG2与鲤科鱼的同系物亲缘关系最近,其活性中心内的Mn2+结合位点与哺乳动物同系物保守,并且它们的蛋白质二级结构也保守。通过生物信息学方法预测发现几乎所有鱼类的ARG1和ARG2都定位在线粒体中。通过组织分布分析发现草鱼ARG1在肝脏和肾脏中分布较多,而ARG2主要分布在肝脏和鳃。随后在嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila,A.hydrophila）感染草鱼的活体实验中发现,肾脏和肝脏组织中ARG1和ARG2的m RNA表达水平上调,而iNOS的基因表达没有变化。在哺乳动物中发现ARG与iNOS存在底物竞争关系,因此推测在草鱼中ARG可能通过竞争底物对iNOS活性产生抑制。因此使用能够同时表达ARG和iNOS的草鱼原代头肾单核/巨噬细胞（Monocytes/Macrophages,Mο/Mφ）作为细胞模型进行体外实验,在细胞层面上探究ARG的功能。使用多种细胞因子分别处理草鱼头肾Mο/Mφ后,发现ARG2的m RNA水平上调时,iNOS的m RNA水平下调,反之亦然,提示ARG2和iNOS之间可能存在联系。在草鱼头肾Mο/Mφ中几乎检测不到ARG1的基因表达,ARG1也不受细胞因子的调控,因此认为在草鱼头肾Mο/Mφ中的ARG活性主要来自ARG2。进一步,在草鱼头肾Mο/Mφ中,抑制上调的ARG2活性能促进NO产量上调,NO主要由iNOS产生,表明ARG2能够抑制iNOS的活性。单独使用HI-A.hydrophila处理草鱼头肾Mο/Mφ,且在处理12-72小时后ARG2和iNOS都被诱导表达,表明ARG2和iNOS在时间水平上有竞争的基础。而过表达融合绿色荧光蛋白（EGFP）的草鱼ARG2后确定其为线粒体定位蛋白,在空间水平上与定位在胞质中的iNOS没有重合。病原体侵入后,会诱导巨噬细胞中iNOS的大量表达,随后产生NO对病原体进行清除。但NO能够与超氧阴离子结合生成过氧亚硝酸根（peroxynitrite,ONOO-）,ONOO-能够引起蛋白质氨基酸残基的氧化和硝化导致蛋白质失活,从而导致细胞的损伤,通常以酪氨酸硝化形成的硝基酪氨酸作为ONOO-的检测指标。基于在草鱼头肾Mο/Mφ中ARG2与iNOS之间的竞争关系,为了探究ARG2能否抑制NO导致的细胞损伤,同时使用ARG抑制剂处理HI-A.hydrophila刺激的草鱼头肾Mο/Mφ,发现抑制ARG2活性后,硝基酪氨酸水平出现上调,表明ARG2在NO引起的细胞损伤中发挥了作用。本研究首次在鱼类细胞中鉴定了ARG和iNOS的竞争关系,并发现ARG对NO导致的细胞损伤存在抑制作用,为明确硬骨鱼ARG的功能地位提供了线索。
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