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兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)能引起多品种兔(Oryctolagus cuniculus)的急性、致死性传染病——兔病毒性出血症(Rabbit hemorrhagic disease,RHD),俗称“兔瘟”。虽然兔病毒性出血症病毒仅有一种血清,但是却已遗传演化出多个不同的基因型,并导致其致病性和抗原发生变化。目前,我们对RHDV的致病机理以及不同基因型(主要是RHDV2/b与classic RHDV)之间的抗原变异机制还存在较多的盲点。更缺乏可以同时抵抗RHDV2/b和classic RHDV感染的的新型疫苗。鉴于此,本论文首先利用生物信息学软件比较和分析了classic RHDV和RHDV2/b的基因序列及衣壳蛋白生物信息特征的差异。然后,利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统,构建了一种可同时表达classic RHDV-VP60和RHDV2-VP60的重组杆状病毒,最后通过动物实验对重组杆状病毒的免疫原性进行了评估,为进一步研制兔瘟二价疫苗奠定了基础。本论文研究内容主要包括以下三个方面:(1)对RHDV基因组的生物信息学分析:使用ClustalW、RDP v4.56、Diverge 3.0 Beta 1等生物信息学软件,对GenBank收录的230条兔出血症病毒及兔杯状病毒(RCV)全基因组序列和衣壳蛋白的编码序列进行了比对和生物信息学分析,发现不同基因亚型RHDV和RCV之间的差异主要体现于衣壳蛋白(VP60)的多个氨基酸位点的突变;通过对VP60种的功能分化相关位点进行检测,发现该蛋白存在许多保守的功能分化相关位点,这些位点构成了7个可变区域;利用DTU Health Tech在线网站对不同亚型RHDV VP60进行蛋白翻译后修饰预测,发现不同亚型RHDV VP60存在亚型内保守的潜在N-糖基化修饰位点,并推测其可能影响RHDV2和classic RHDV之间的生物学差异。(2)RHDV病毒样颗粒的制备:将RHDV及RHDV2的VP60基因分别插入pFastBac Dual载体,获得阳性重组质粒ssic(pRHDV VP60-RHDV2 VP60),制备重组穿梭质粒后转染SF9昆虫细胞,成功拯救出重组杆状病毒。分别使用Western blot和IFA方法检测重组病毒,结果表明,被感染的昆虫细胞可以高效共同表达classic RHDV VP60和RHDV2 VP60重组蛋白,且重组蛋白在感染后72 h达到峰值;电镜检测发现重组VP60蛋白可以自我组装形成病毒样颗粒(VLPs)。(3)RHDV二价病毒样颗粒疫苗的免疫原性及免疫效力检测:为了评估重组杆状病毒的免疫原性及对动物的保护力,首先将重组杆状病毒灭活,然后添加佐剂进行乳化,做成灭活疫苗。最后用疫苗免疫SPF新西兰兔。同时,设置阴性对照组(免疫SFM900II培养基)。分别于免疫前及免疫后7、14及21天采集血清样本,使用间接ELISA方法,检测兔体内的特异性抗体及IFN-γ、IL-4等细胞因子水平。检测结果表明,与对照组相比,二价VLPs疫苗可以同时诱导SPF兔产生高水平的体液免疫和细胞免疫;血凝抑制实验结果则显示,二价VLPs疫苗所诱导的特异性抗体具有良好的中和病毒活性;攻毒保护性实验结果证明,研制的二价VLPs疫苗可以保护兔抵抗classic RHDV的保护。病理剖检和病理组织学检测结果进一步证明,该疫苗可以抑制RHDV强毒在兔体内的复制。与阴性对照组相比,免疫兔不表现任何RHDV的临床症状和病理变化,从各个脏器中也检测不到RHDV的基因组。通过对免疫兔的抗体持续期检测,发现研制的二价VLPs在兔体内诱导的抗体可以高水平持续5个月以上,证明该疫苗可以为SPF兔提供一个长效的保护。综上所述,本论文对classic RHDV和RHDV2进行生物信息学分析。发现其差异主要是由VP60的氨基酸突变造成的,这些突变可能导致了不同亚型RHDV的生物学差异;构建了可以同时表达classic RHDV VP60和RHDV2 VP60的重组杆状病毒,证明其具有良好的免疫原性且能够提供针对classic RHDV的完全保护;根据针对RHDV2 VP60的特异性抗体水平,推测其同样可以提供针对RHDV2的完全保护。本研究为了解classic RHDV和RHDV2的差异机制及商品化二价疫苗的研发奠定了基础。