阴沟肠杆菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性的初步研究

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阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)是肠杆菌科革兰阴性杆菌,广泛分布于自然界,亦可存在于人和动物肠道中。阴沟肠杆菌是临床感染常见的致病菌,可引起败血症、呼吸道感染、尿道感染和腹膜炎等疾病。近年来,由于阴沟肠杆菌对β-内酰胺酶类、喹诺酮类及氨基糖苷类抗生素均出现较高耐药率,使得治疗该细菌感染面临难题。噬菌体是一类可以侵袭细菌的病毒,广泛分布于自然界中,对其宿主菌具有高度的特异性和高效裂解性,有望成为新型的抗菌制剂。虽然噬菌体的研究开展已久,但国内外尚未见有关阴沟肠杆菌噬菌体的深入研究报道。本研究以阴沟肠杆菌为宿主菌,从居民区污水中分离获得4株阴沟肠杆菌噬菌体,通过噬斑法反复纯化,筛选出1株裂解性强的毒性噬菌体,命名为ФEc53,并对其进行了生物学特性的研究及抗感染应用的初步研究。噬菌体ФEc53的生物学特性经3~5次反复纯化后,在双层琼脂上可形成直径约为2~4mm的圆形、透明、边界清晰的噬菌斑。电子显微镜下,该噬菌体头部呈球形,直径约60nm,有一长尾约130nm。根据噬菌体的新分类法,ФEc53属于有尾病毒目、管尾噬菌体科(Caudovirales,Siphovirida)。对ФEc53提取核酸后进行脉冲场电泳及琼脂糖凝胶电泳,结果表明:该噬菌体的基因组大小为37.7kb左右,含EcoRⅠ、EcoRⅤ、BamHⅠ和NdeⅠ的多个酶切位点。通过SDS-PAGE对噬菌体蛋白进行分析表明,噬菌体颗粒至少含有8种衣壳蛋白,其中相对分子量为22kD的蛋白条带含量较大,表明这种蛋白在噬菌体病毒颗粒中所占比例较高,可能为主要衣壳蛋白。将噬菌体与宿主菌按照一定比例(分别为MOI=0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001)进行混合,37℃振荡培养,每隔12min取出测定细菌浓度,确定最佳感染复数为0.01。选取最佳感染复数进行一步生长曲线的测定及绘制,噬菌体ФEc53感染宿主菌的潜伏期约为5min,根据爆发量=噬菌体爆发末期的噬菌体滴度/感染初期细菌的浓度的公式计算,爆发量为6.06×10~3PFU/cell,在50min时到达平台期。通过超滤的浓缩方法可提高噬菌体滴度,并降低内毒素含量。经宿主特异性及裂解范围实验表明,该噬菌体有高度的特异性,仅能裂解1株阴沟肠杆菌,为窄谱噬菌体。经过7个月的保存实验证明:保存于4℃和-70℃中的噬菌体的滴度并未发生明显变化。噬菌体对皮下脓肿感染动物模型的治疗实验建立家兔皮下脓肿感染模型,皮下注射阴沟肠杆菌53后,立即在相同部位皮下注射ФEc53,观察并记录脓肿情况,测定脓肿部位、肝脏及脾脏内的细菌数量及噬菌体滴度。结果表明,噬菌体治疗组脓肿面积随时间推移逐渐减小,脓肿内部细菌量有所下降的同时噬菌体量有所升高。本实验初步研究了ФEc53的生物学特性及其抗感染治疗,为今后噬菌体的深入研究提供一些依据。
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