研究背景:本课题组前期研究发现,严重烧伤后早期心肌即已发生缺血缺氧损害。细胞实验结果提示,微管相关蛋白4（microtubule associated protein 4,MAP4）磷酸化增高是引起心肌细胞缺血缺氧损害的重要机制。但是在临床患者和在体动物中,MAP4持续磷酸化增高会对心脏产生何种病理生理影响我们尚不明确。因此,探究MAP4持续磷酸化的病理生理意义有助于我们进一步认识严重烧伤后心肌缺血缺氧损害的可能机制,并为临床防治心肌缺血缺氧损害提供重要靶点和方向。作为调节细胞骨架动力学的重要分子,微管相关蛋白家族（microtubule associated proteins,MAPs）具有与微管（microtubule,MT）结合并促进其聚合的特性,当MAPs磷酸化增加时,其活性下降,导致微管解聚。常见的三种MAPs包含MAP4,MAP2和tau,这其中仅有MAP4广泛表达于非神经元细胞,而MAP2和tau多表达于神经元组织中。既往大量研究表明,位于人源性微管结合域内的脯氨酸富集区域的丝氨酸696、768和787位点磷酸化水平的改变,对于调节微管动力学有着重要意义,而且丝裂原活化蛋白激酶激酶6/p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase kinase 6,MKK6）/（p38 mitogen-activated protein kinase,p38/MAPK）是介导缺氧条件下MAP4磷酸化增高和微管解聚的重要上游激酶。除了微管动力学改变,本课题组前期的体外实验还证明了MAP4磷酸化对于心肌细胞线粒体途径凋亡具有重要作用:MAP4磷酸化后与微管蛋白结合力下降,从微管蛋白上脱落后转位到线粒体上,继而引起线粒体通透转换孔的开放和细胞色素c的释放,从而启动线粒体凋亡的发生。尽管如此,当MAP4持续磷酸化时,微管动力学和线粒体的变化会在在体动物中引起何种改变,以及产生的临床效应如何,均有待进一步探索。因此,本研究通过观察缺氧和压力负荷心脏疾病动物模型心肌组织,以及法洛四联症患者心肌标本中MAP4磷酸化的改变,了解其在心脏疾病中的普遍意义;继而通过构建MAP4定点突变的基因敲入小鼠模拟MAP4持续磷酸化,探索其在在体动物上可能导致的病理生理效应及其具体机制,旨在深入揭示临床相关疾病发生机制,并为其治疗提供新的方向和靶点。材料和方法:1.从新桥医院心外科收集16例经手术治疗的法洛四联症（tetralogy of fallot,TOF）患者的肥厚心脏右心室标本（约100 mg）,并根据患者动脉血氧饱和度（arterial oxygen saturation,SaO₂）分为两组（SaO₂<90%和SaO₂≥90%,各8例）;构建心肌梗塞（myocardial infarction,MI）和主动脉缩窄（transverse aortic constriction,TAC）小鼠动物模型,分别获得其左心室心肌标本;通过免疫印迹对所获得的三种心肌病理标本进行检测,了解MAP4（S696,S768,S787）（对应小鼠位点为S667,S737,S760）和p38/MAPK磷酸化水平在不同类型心脏疾病中的变化情况。2.委托上海南方模式生物科技发展有限公司通过基因编辑技术（clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein 9,CRISPR/Cas9）构建MAP4（S667A,S737E,S760E）基因敲入小鼠（MAP4 KI）,并利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术对小鼠进行鉴定。分别对10-14、30-34和70-74周龄的野生型（wild type,WT）和MAP4 KI小鼠进行观察检测,通过超声心动图、无创血压、试剂盒、免疫印迹、免疫荧光、病理切片染色、透射电镜、大体检测、免疫组化等多种方法和手段了解MAP4磷酸化对心脏形态、功能和病理变化的影响。同时,我们通过构建模拟MAP4（S768A和S787A）去磷酸化突变体（MAP4（alanine,Ala（A）））转染WT和MAP4 KI原代小鼠乳鼠心肌细胞或成纤维细胞,干预异丙肾上腺素（isoprenaline,ISO）（20μM）介导的体外病理性心脏重塑模型,进一步明确MAP4磷酸化在病理性心脏重塑中的作用。3.通过收集10-14和70-74周龄的WT和MAP4 KI小鼠的左心室心脏组织,利用原位末端凋亡法（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL）试剂盒、病理切片染色、免疫印迹和透射电镜观察心肌细胞凋亡、坏死和坏死性凋亡、线粒体凋亡关键酶和线粒体超微结构损伤情况,通过分离提取小鼠心脏组织线粒体和非线粒体样本,利用免疫印迹法检测线粒体细胞色素c的释放情况;然后利用病理切染色、透射电镜和TUNEL组化染色法对TOF患者的右心室心脏标本进行检测,明确TOF患者心脏标本中心肌细胞凋亡和线粒体损伤情况;此外,利用MAP4（Ala）转染原代小鼠乳鼠心肌细胞,以ISO刺激48小时,通过免疫荧光共染、免疫印迹和透射电镜对心肌细胞凋亡、线粒体凋亡关键酶和线粒体超微结构进行检测,同时分离提取原代小鼠乳鼠心肌细胞线粒体和非线粒体成份,利用免疫印迹法检测原代心肌细胞线粒体细胞色素c的释放情况,以此明确MAP4磷酸化对心肌细胞凋亡的影响。4.收集10-14和70-74周龄的WT和MAP4 KI小鼠心脏标本,分别提取游离态和聚合态微管蛋白、线粒体和非线粒体成份以及细胞总蛋白,通过免疫印迹和免疫共沉淀法对MAP4与微管蛋白之间的相互作用、游离态和聚合态微管蛋白表达情况以及MAP4线粒体磷酸化转位情况进行检测;同时,体外培养WT和MAP4 KI原代小鼠乳鼠心肌细胞和成纤维细胞,分离获取细胞总蛋白、线粒体和非线粒体蛋白、聚合态和游离态微管蛋白,通过转染MAP4（Ala）、p38/MAPK抑制剂SB203580（5μM）或MKK6（谷氨酸（glutamic acid）,Glu（E））预处理细胞,以ISO刺激细胞48小时,然后利用免疫印迹、免疫荧光、透射电镜对细胞微管蛋白的结构和含量、心肌细胞凋亡、心肌细胞肥大和纤维化、细胞线粒体损伤以及线粒体细胞色素c释放情况分别进行检测,以此明确MAP4磷酸化介导病理性心脏重塑的可能机制。结果:1.通过免疫印迹检测发现,SaO₂<90%较SaO₂≥90%的TOF心脏标本提示,MAP4（S768和S787）磷酸化在缺氧组明显增加,而MAP4（S696）磷酸化和MAP4表达无显著差异;在MI小鼠模型中,血管结扎60、180和360 min后,MAP4（S667,S737,S760）磷酸化均较假手术组明显增高,而结扎5 min后未见明显差异,同时p38/MAPK的激活和MAP4磷酸化的变化趋势一致;而对于TAC小鼠模型,手术后3周获得左心室心脏标本,检测发现MAP4（S737和S760）磷酸化较假手术组明显增高,而MAP4（S667）磷酸化和MAP4表达较假手术组无显著差异,不仅如此,p38/MAPK在TAC手术后3周也较假手术组明显激活。2.首先我们成功构建并鉴定MAP4 KI小鼠,以同窝小鼠进行实验。通过免疫印迹检测发现,WT与MAP4 KI在正常状态下,MAP4（S667）磷酸化水平无明显差异,且表达量均很低,而MAP4 KI小鼠较WT小鼠的心脏MAP4（S737和S760）显著增高,提示模型构建成功。然后对10-14、30-34和70-74周龄的WT和MAP4 KI小鼠进行心脏肥大指标的观察检测,发现MAP4 KI小鼠在30-34周和70-74周时,心脏重量（heart weight,HW）、心脏重量/体重（heart weight/body weight,HW/BW）和心脏重量/胫骨长度（heart weight/tibia length,HW/TL）分别较对照组小鼠增加22%、19%和23%,心脏大体可见左心室游离壁和室间隔明显增厚;在体心功能提示,MAP4 KI小鼠较WT小鼠表现为年龄依赖性的心脏舒缩功能减退,且舒张功能异常早于收缩功能异常;而且心肌细胞横截面面积、心脏肥大标志物心房钠尿肽（atrial natriuretic peptide,ANP）和肌球蛋白重链7（myosin heavy chain 7,MYH7）也明显增高,肌小节超微结构可见肌丝溶解和稀疏,呈现年龄依赖性的破坏加重,而在10-14周时,WT与MAP4 KI小鼠在上述指标方面无显著差异。此外,WT与MAP4 KI小鼠血压在各年龄段均无显著差异。而对于心脏纤维化指标,在30-34周时,MAP4 KI小鼠较WT小鼠表现为血管内皮细胞旁胶原沉积、细胞外基质蛋白和平滑肌肌动蛋白增加,而大体胶原染色则仅在70-74周时才出现显著增加,在10-14周时,上述指标在WT和MAP4 KI小鼠之间无明显差异。在细胞实验中,我们通过转染MAP4（Ala）抑制MAP4磷酸化,同时用ISO刺激原代小鼠乳鼠心肌或成纤维细胞,继而诱导心肌肥大和纤维化,结果提示,ISO能够诱导心肌肥大和纤维化的发生,且MAP4 KI较WT原代细胞更为明显,而转染MAP4（Ala）能够有效抑制ISO诱导的原代心肌细胞肥大和细胞外基质分泌,表现为心肌细胞肥大标志物ANP、MYH7和脑钠肽（brain natriuretic peptide,BNP）的表达降低和心肌细胞横截面面积减小,以及成纤维细胞分泌的I型胶原、III型胶原、纤维连接蛋白和平滑肌肌动蛋白表达减少,且这种改变在WT原代细胞中较MAP4 KI原代细胞中抑制的更为明显。3.我们获得10-14和70-74周龄的WT和MAP4 KI小鼠的心脏组织标本并进行检测,结果发现,在10-14周龄时,MAP4 KI小鼠心脏中活化的半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3（cleaved caspase-3）、线粒体细胞色素c的释放、线粒体超微结构损伤和心肌细胞凋亡均较WT组明显增加,而到70-74周时,这些破坏效应更加明显;而心肌组织坏死和坏死性凋亡的蛋白标志物在各个年龄段均无显著改变;而在TOF心脏标本中,我们观察到,缺氧组较常氧组心肌组织凋亡比例显著增加;同样地,我们通过体外培养WT和MAP4 KI小鼠乳鼠原代心肌细胞,并以ISO进行刺激,发现转染MAP4（Ala）能够有效抑制ISO导致的心肌细胞凋亡和线粒体破坏增加,表现为cleaved caspase-3表达降低、细胞色素c释放减少,以及TUNEL标记的心肌凋亡阳性细胞减少和线粒体超微结构破坏减轻。4.通过对10-14和70-74周龄WT和MAP4 KI小鼠心脏标本检测发现,10-14周时,MAP4 KI较WT小鼠已经出现聚合态微管蛋白的减少和游离态微管蛋白的增加,而且MAP4发生线粒体磷酸化转位增加。在体外实验中,使用ISO处理原代小鼠乳鼠心肌或成纤维细胞,并应用MAP4（Ala）和p38/MAPK抑制剂SB203580转染或预处理细胞,结果发现,MAP4（Ala）和SB203580能够有效抑制ISO导致的心肌细胞微管破坏、MAP4线粒体磷酸化转位增加和线粒体超微结构破坏、心肌细胞凋亡增加和成纤维细胞分泌细胞外基质蛋白增加,不仅如此,转染MAP4（Ala）还能够抑制MKK6（Glu）激活p38/MAPK导致的心肌细胞凋亡增加、微管破坏和线粒体损害。结论:不论在缺氧和压力负荷心脏疾病动物模型,还是法洛四联症患者,心肌组织中MAP4磷酸化水平都较对照组显著增加。MAP4持续磷酸化导致病理性心脏重塑的发生发展,主要表现为心肌肥厚、纤维化、舒张和收缩功能下降。微管解聚、磷酸化MAP4线粒体转位以及心肌细胞凋亡增加可能是介导MAP4磷酸化引起病理性心脏重塑的重要机制,p38/MAPK则是介导MAP4磷酸化的重要上游激酶。以上结果有助于我们进一步深入认识心肌细胞通过何种途径感受缺血缺氧损害信号的这一科学问题,丰富了心脏缺血缺氧损害和心脏重塑发病机制的研究内容,为相关疾病的干预和治疗提供新靶点和方向。