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羟基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)是人体和动物骨骼、牙齿的主要无机成分，在骨质中，HA大约占60％。人工合成的HA与人体正常骨的磷灰石结晶相似，具有良好的生物活性和生物相容性，植入人体后能在短时间内与人体的软硬组织形成紧密结合，为新骨的沉积与再生提供优良的生理支架，因此，HA作为一种生物性能优越的骨替代材料被广泛应用于临床。尤其纳米尺寸的羟基磷灰石(nanoscale particle of hydroxyapatite，nHA)因具有纳米材料特有的表面效应，小尺寸效应(又称体积效应)等特点，在生物医学不同领域得到广泛应用。但是由于陶瓷材料的脆性，难成型等特点限制了它的应用。复合材料是指一个宏观或微观的尺寸范围内，含有两种或多种不同成分或不同相的材料。复合材料既能保留原组成材料的主要特性，又能通过复合效应获得原组分所不具备的性能。可以通过材料设计使各组分的性能互相补充并彼此关联，从而获得新的优越性能，因此复合材料的应用领域正在逐步增加。将HA与天然或人工合成的高分子材料复合得到的新型复合材料一方面与自然骨的结构更相似，同时又避免了HA颗粒易流失和脆性大的不足。壳聚糖(Chitosan，CS)是一类重要的碱性天然多糖，它由甲壳素(chitin)经脱乙酰化反应而得，在自然界中广泛存在于低等生物菌类，在体内最终代谢产物为N-乙酰葡萄糖和氨基多糖，是天然代谢产物，对机体无害。它良好的塑形性及可加工性赋予CS复合物优良的理化特性。目前已成功地用作手术缝合线、伤口敷料、药物缓释剂、缺损填充物及组织工程支架等。本研究首先制备nHA，然后将nHA与CS复合，并对该复合材料进行检测分析，然后将复合材料与成纤维细胞共培养，观察该复合材料对成纤维细胞粘附行为的影响，评估其生物相容性。第一部分纳米羟基磷灰石-壳聚糖复合材料的制备及检测分析材料和方法采用溶胶-凝胶(sol-gel)法，以四水硝酸钙和磷酸三甲酯分别作为钙和磷的前驱体，制备HA。在前驱溶液中加入柠檬酸(citric acid，CA)作螯合剂，制备nHA。冷冻干燥法制备nHA／CS复合材料，并对材料进行X射线衍射(X-ray diffraction，XRD)，傅里叶变换红外光谱(Fourier transformed infrared spectroscopy，FT-IR)，扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEN)和透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)分析。结果1．XRD分析结果表明溶胶-凝胶法制备的HA和nHA的晶体结构符合标准HA的空间六方晶体结构。2．TEM分析结果表明复合材料中HA为纳米级颗粒；电子衍射分析显示HA为晶体结构。3．SEM下冷冻干燥法制备的复合材料和单纯CS支架表面结构相似，都为多孔材料，能量色散X线分析(energy dispersive x-ray analysis，EDAX)显示出两种材料成分的变化；复合材料中nHA在CS基质中分散比较均匀。4．在红外区存在HA，nHA和CS的主要官能团，没有新的吸收峰值出现，表明nHA和CS在复合物中都存在，但两种特征峰仅仅是简单的叠加，二者未发生明显的化学反应。结论采用sol-gel法，以CA作为螯合剂，可以制备出nHA。冷冻干燥法复合nHA与CS得到的复合材料中，两种物质在复合物中都存在，二者未发生明显的化学反应，各自保持本身材料的完整性。第二部分纳米羟基磷灰石-壳聚糖复合膜对成纤维细胞的粘附作用材料和方法制备2％CS／nHA复合膜和2％CS／HA复合膜，然后将两组膜分别与NIH3T3细胞共培养，倒置显微镜下观察NIH3T3细胞在复合材料表面粘附形态同时进行粘附数量的测定。结果1．倒置显微镜下观察见细胞贴壁伸展良好，共培养3天，5天，7天后两种复合膜上及膜旁边各处均有细胞生长，细胞呈梭形或多角型，胞体透明。2．细胞粘附数量显示共培养3天后，nHA／CS膜组细胞粘附数量与HA／CS组无显著性差别，但是共培养5天，7天后nHA／CS组细胞粘附数量高于HA／CS组，差异有显著性(p＜0.05)。结论2％CS／nHA与2％CS／HA膜都为半透明的，可以直接在倒置显微镜下观察细胞的生长状况。实验中，两组膜上细胞贴壁，伸展情况良好。5天、7天后nHA／CS膜组细胞粘附数量高于HA／CS组，说明nHA相比致密HA有促进细胞增殖作用。第三部分成纤维细胞在多孔纳米羟基磷灰石-壳聚糖三维立体支架材料上的粘附观察材料与方法冷冻干燥法制备2％CS／nHA复合支架，将致密HA制成与2％CS／nHA复合支架同样大小的圆盘状，然后将NIH3T3细胞与两组材料置于培养板共培养5、7、9天后，扫描电镜观察细胞在两种材料表面的粘附形态同时进行细胞粘附数量的测定和能谱分析。结果1．倒置显微镜下观察nHA／CS复合支架组培养液澄清，材料周围细胞呈梭形或多角型，胞体透明。致密HA组培养液中有少量HA颗粒从盘状HA片中游离，但是HA颗粒并没有影响细胞生长。2．SEM下致密HA观察结果：电镜下见细胞以多个突起粘附于材料表面，并具有良好的伸展状态。3．SEM下nHA／CS观察结果及EDAX分析：电镜下见细胞以多个突起粘附于材料表面，伸展良好，可见细胞爬过孔的表面。高倍镜下EDAX分析显示无细胞粘附的材料表面和有细胞粘附的材料表面的化学成分的变化，其中碳的含量从47.07％增加到57.81％，而钙的含量从10.27％下降到1.09％。4．与NIH3T3细胞共培养5天，7天，9天后nHA／CS材料表面的细胞粘附数量高于致密HA组，差异有显著性(p＜0.05)。结论NIH3T3细胞可以在致密HA和nHA／CS材料上和材料周围粘附、生长、增殖。nHA／CS材料表面的细胞粘附数量高于HA组表明该复合材料有促进细胞增殖的作用。