FOXA1基因变异和调控异常促进肝癌发生与转移的机制研究

来源 :复旦大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:chenjiechn
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肝细胞癌是常见的高度恶性肿瘤,其病程短、发展快、死亡率高,严重威胁着人类的健康。由于肝癌发病机制十分复杂,科学界对其发病原因尚无定论,已知的诱因包括病毒感染、黄曲霉毒素摄入、肝脏长期慢性炎症、肝硬化等,而性别差异是HCC发生发展的一个非常重要的特征。人群流行病学调查发现:男性HCC平均发病率是女性的3-5倍,而对于年龄在50岁以下的男性,HCC发病率则达到女性的7-10倍。在预后方面,男性患者生存率低、生存期短,而女性治疗后具有相对较高的生存率和较低的复发率。目前普遍认为:这种性别差异主要是由男女体内性激素水平及相应受体(AR和ER)的差异引起的。在对前列腺癌和乳腺癌的研究中发现,转录因子FOXA1广泛地参与AR和ER通路,影响肿瘤进程。在前列腺癌中,FOXA1影响AR对其下游基因的调控,FOXA1的高表达,与前列腺癌的转移复发显著相关;在乳腺癌中,ER对其下游基因的调控需要FOXA1的参与,FOXA1的高表达,预示更长的无病生存期和总生存期。那么,作为同样具有性别差异的肝癌来说,FOXA1是否也发挥着相同或相似的功能呢?2012年,Li等人报道:用肝癌诱导药物作用于Foxal基因敲除的小鼠,原本不易诱发肝癌的雌性小鼠变得容易罹患肝癌,而雄性小鼠却不易诱发肝癌,从而第一次证明FOXA1在肝癌发生及性别差异中发挥了举足轻重的作用,其功能或表达水平异常会严重影响肝脏的正常生理功能。基于前人的研究结果,本论文从FOXA1基因变异和调控异常两个方面着手,对FOXA1与肝癌发生、发展及转移机制进行了探讨。第一章FOXA1基因变异与肝癌易感性的关联及其机制研究肝癌的发生是内因、外因共同作用的结果。遗传学研究发现:个体是否患肝癌在很大程度上取决于个体的遗传易感性。对肝癌患者及其亲属的研究表明:遗传因素与肝癌的发生具有显著的关联。找到与遗传易感性相关的基因或基因变异,并发现其导致肝癌发生的机制,对于肝癌的防治具有重要意义。我们前期的关联研究发现:FOXA1基因编码区第247位碱基多态性(rs7144658, A247G, Thr83Ala)与肝癌易感性显著相关(P<0.05)。为了从生物学角度解释关联的结果,我们借助ChIP-qPCR和报告基因实验等技术手段开展了FOXA1基因变异增加肝癌易感性的机制研究。实验结果显示:FOXA1基因编码区第247位碱基由A变异为G后,其与靶基因启动子区的结合能力显著降低(P<0.05),从而影响FOXA1调控的靶基因的表达水平,增加FOXA1/+247G基因型携带者的肝癌易感性。本章的主要内容如下:1. FOXA1基因编码区第247位碱基A/G多态性与肝癌易感性显著相关。基于本室前期的样本-对照分析研究发现:FOXA1基因编码区第247位碱基多态性(rs7144658, A247G, Thr83A1a)与肝癌易感性显著相关(P<0.05),SNP+247A>G的A/G及G/G基因型比A/A基因型显著增加肝癌的患病风险(P<0.05; OR,1.35; 95% CI,1.09-1.67).2. FOXA1基因编码区第247位碱基A到G变异减弱FOXA1与靶基因启动子区的结合能力。在HepG2细胞中分别转染pcDNA3.1-FOXA1/247A和pcDNA3.1-FOXA1/247G后,开展ChIP-qPCR实验。实验结果证实:FOXA1/247G对其调控基因(如DIO1、UGT2B17、p27Kipl和NTCP)的启动子区的结合能力显著低于FOXA1/247A (P<0.05)。3. FOXA1基因编码区第247位碱基A到G变异影响FOXA1的转录激活能力。通过对D1O1、UGT2B17、p27Kipl和NTCP的报告基因实验,我们证实:FOXA1/247G对DIO1和UGT2B17的转录激活能力低于FOXA1/247A,对p2严ipl的转录激活能力高于FOXA1/247A,而对NTCP的转录激活能力没有明显差别,说明该位点变异会影响FOXA1对其靶基因的转录激活能力。4.肝癌组织样本中FOXA1基因编码区第247位碱基多态性影响靶基因表达水平。为了从组织水平验证我们的结论,我们对97例外科手术切除的肝癌组织进行了基因分型,其中67例为A/A基因型,27例为A/G基因型,3例为G/G基因型。随后我们分别检测了这些组织中DIO1、UGT2B17、p27Kipl和NTCP基因的mRNA水平。在A/G和G/G基因型组织样本中,DIO1基因(P<0.05)和UGT2B17 (P<0.05)基因表达水平均显著低于A/A基因型组织样本,p27KiPl基因(P<0.0001)表达水平显著高于A/A基因型组织样本,NTCP基因表达水平没有显著差异,以上结果与报告基因结果完全一致。5. ER影响FOXA1与基因组DNA的结合能力,且对FOXA1/247A和FOXA1/247G的影响程度不同。ER虽然不影响FOXA1结合到NTCP基因启动子区的能力,但是却能增强FOXA1蛋白结合到DIO1基因启动子区的能力。对于UGT2B17和P27Kipl,ER能够减弱FOXA1结合到他们的启动子区,且对FOXA1/247A的影响程度大于FOXA1/247G。6.ER影响FOXA1的转录激活能力,且对FOXA1/247A和FOXA1/247G的影响程度不同。ER一方面可以增强FOXA1对DIO1、UGT2B17和NTCP基因的转录激活能力,扩大FOXA1/247A与FOXA1/247G对DIO1转录激活能力的差异,另一方面可以减弱FOXA1对p27Kipl的转录激活能力,消除FOXA1/247A与FOXA1/247G对p27Kip1基因转录激活能力的差异。7. FOXA1基因编码区第247位碱基A到G变异减弱FOXA1与ER的亲和能力。在HepG2细胞中分别过表达FOXA1/247A和FOXA1/247G后,我们通过Co-IP实验不仅验证了FOXA1与ER存在相互作用,还发现FOXA1/247G与ER的亲和力约为FOXA1/247A的40%,这从一定程度上解释了先前的实验结果。FOXA1作为肝脏核因子之一,在维持肝脏正常功能中发挥着不可替代的作用,其基因变异所引起的转录功能异常会影响肝脏的正常生理功能,从而增加机体患癌的风险。FOXA1在肝癌发生中起到抑癌作用还是促癌作用目前还没有定论,科学界普遍倾向于它是一个抑癌因子,其功能异常会增加机体患癌的风险。我们的研究结果也支持"FOXA1是一个抑肝癌因子”的结论,其基因编码区第247位碱基A→G变异,会降低FOXA1结合其调控基因启动子区的能力,引起下游基因在转录水平上的变化,这些基因表达水平的变化势必会影响到肝脏的正常功能,使机体长期处于一种“亚健康状态”,减弱机体抵抗内在及外在致癌因素的能力,从而增加个体罹患肝癌的风险。第二章FOXA1介导WTl促肝癌转移机制研究肝癌的转移和复发是肝癌致死的最主要原因,也是临床肝癌治疗和预防的最大挑战。肝癌的转移复发是一个多步骤形成、多基因参与并不断变化的过程,与肝癌转移复发相关的分子标志物和治疗靶标也非常的复杂多样。因此,找到与肝癌转移和侵袭相关的基因并发现其导致肝癌转移的机制,对于肝癌的治疗具有重要意义。在本部分研究中,我们发现FOXA1基因的表达受到WT1的调控,并通过实验证明:WTl在肝癌细胞中的过量表达会使FOXA1的表达长期处于较高的水平,FOXA1表达量的变化,又使其对下游基因(如AFP、AGR2、p27Kipl等)的调控发生异常,最终促进肝癌的转移能力。本章的主要研究内容如下:1. WT1、FOXA1、AGR2蛋白表达量与肝癌转移能力正相关。在对不同侵袭能力的肝/肝癌细胞系蛋白表达水平检测中,我们发现:WT1、FOXA1、AGR2蛋白表达水平均随肝癌细胞侵袭能力增加而增加,并呈现显著的一致性。侵袭能力最强的MHCC97H细胞中具有最高的蛋白表达水平,侵袭能力稍弱的MHCC97L细胞中,蛋白表达水平有所降低,在其他侵袭能力较弱甚至无侵袭能力的细胞系(L02、Chang’s、HepG2、Hep3B和Huh7)中表达水平显著降低甚至检测不到他们的表达。2.WT1正调控FOXA1的表达。在过表达WT1不同剪接体的HepG2细胞中,除了WT1-1组,其他三组中FOXA1的蛋白表达水平均显著升高。经报告基因实验证实:WT1可以上调FOXA1的表达水平。随后,我们以不同浓度的pcDNA3.1-WT1-4质粒与报告基因质粒共转染HepG2细胞,结果显示:FOXA1及AGR2荧光素酶活性随着WT1转染质粒浓度的增加而呈现递增的趋势。3.WT1不影响细胞的增殖能力,但其剪切体WT1-4可以显著增强HepG2细胞的增殖能力。在MHCC97H细胞中下调WT1的表达后,细胞的增殖能力没有明显的变化,说明WT1并不影响细胞的增殖能力。但是在HepG2细胞中分别过表达WT1剪接体WTl-1和WT1-4后,WT1-1组细胞增殖能力没有明显变化,而WT1-4组细胞增殖能力显著上升。细胞周期实验证实:WT1-4可以使HepG2细胞更多的处于G2/M期而进入细胞增殖分裂程序。以上结果说明:从整体水平上看,WT1不影响肝癌细胞的增殖能力,但是WT1第四种剪接体WT1-4具有促进肝癌细胞增殖的功能。4.WT1促进肝癌细胞的体外迁移能力。在MHCC97H细胞中下调WT1的表达,细胞的迁移能力受到明显地抑制。在HepG2细胞中分别过表达WT1的剪接体WT1-1和WT1-4后,WT1-1组细胞的迁移能力没有明显变化,而WT1-4组细胞的迁移能力显著上升,说明WT1能够促进肝癌细胞的体外迁移能力,而其促进肝癌细胞的体外迁移能力可能是通过WT1。4来实现的。5.WT1促进肝癌细胞的体外侵袭能力。在MHCC97H细胞中下调WT1的表达后,细胞的侵袭能力受到明显地抑制。在HepG2细胞中分别过表达WT1的剪接体WT1-1和WT1-4后,WT1-1组细胞的侵袭能力没有明显变化,而WT1-4组细胞的侵袭能力显著上升,说明WT1能够促进肝癌细胞的体外侵袭能力,而其促进肝癌细胞的体外侵袭能力可能是通过WT1-4来实现的。本章研究发现:WT1可以正调控FOXA1基因的表达,进而影响AGR2等FOXA1下游基因的表达水平,促进肝癌的转移。该部分研究一方面发现了FOXA1的表达受到WT1的调控,另一方面也补充完善了本室赵健博士关于AGR2促肝癌转移的机制研究。
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