【摘 要】
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目的探讨关节腔注射IRAK4 sh RNA的腺病毒（Ad-sh IRAK4）介导的IRAK4敲低对兔膝骨关节炎（OA）滑膜炎、软骨损伤和软骨下骨异常变化的影响,明确IRAK4是否可以作为干预滑膜炎、改善OA病理的新靶点。方法6只新西兰大白兔随机分为假手术组（control,n=3）和骨关节炎模型组（OA,n=3）。采用右膝前交叉韧带切断术建立兔膝骨关节炎模型。术后6周,对兔膝关节进行大体观察和x线
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目的探讨关节腔注射IRAK4 sh RNA的腺病毒（Ad-sh IRAK4）介导的IRAK4敲低对兔膝骨关节炎（OA）滑膜炎、软骨损伤和软骨下骨异常变化的影响,明确IRAK4是否可以作为干预滑膜炎、改善OA病理的新靶点。方法6只新西兰大白兔随机分为假手术组（control,n=3）和骨关节炎模型组（OA,n=3）。采用右膝前交叉韧带切断术建立兔膝骨关节炎模型。术后6周,对兔膝关节进行大体观察和x线扫描,且使用western blot评估正常滑膜组织和OA滑膜组织中IRAK4的表达。25只新西兰大白兔被随机分为假手术组（Control）、骨关节炎模型组（OA）、腺病毒空载体组（Ad-C）、Ad-sh IRAK4低滴度组（Ad-sh IRAK4-L）和Ad-sh IRAK4高滴度组（Ad-sh IRAK4-H）,每组5只。Control组仅切开右膝关节腔,不切断前交叉韧带,其余各组均进行右膝前交叉韧带切断术。术后2周,Ad-sh IRAK4-L组关节腔注射Ad-sh IRAK4（1×10~8pfu）,Ad-sh IRAK4-H组注射Ad-sh IRAK4（1×10~9pfu）。Ad-C组注射腺病毒空载体,Control组和OA组则注射等量的生理盐水。关节腔注射6周后,采用Micro-CT评估膝关节的整体情况和软骨下骨的微观结构变化。打开关节腔,对膝关节滑膜和软骨进行大体评估。q RT-PCR被用于检测滑膜组织中IRAK4、TRAF6、IL-1β的m RNA的表达。通过western blot评估滑膜组织中IRAK4、TRAF6、TAK1、p-IKK、p-NF-κB的蛋白的表达。免疫组化检测滑膜组织中IRAK4、TRAF6、TAK1的阳性表达。此外,免疫组化检测IRAK4蛋白在关节软骨中的表达。H＆E染色被用来评估滑膜和软骨的病理改变。采用ELISA法检测滑液中IL-1β、TNF-α、MMP-13水平。收集数据,进行统计学分析。结果前交叉韧带切断术后6周,Control组股骨髁和胫骨平台软骨表面光滑,且未见缺损和骨赘,也无明显的滑膜增生和关节腔积液。而OA模型组的膝关节表面粗糙,有明显缺损及骨赘,并出现关节积液增多和滑膜增生。Control组的滑膜组织和OA模型组的滑膜组织均可表达IRAK4蛋白。但是,与Control组相比,OA模型组滑膜组织中IRAK4的蛋白表达水平明显上升。H＆E染色结果显示,与Control组相比,OA模型组和Ad-C组滑膜增生严重程度、炎症细胞浸润、血管新生明显增加。然而,在Ad-sh IRAK4-L组和Ad-sh IRAK4-H组,炎症细胞浸润较少,滑膜增生和血管生成减少,但仍高于正常水平。ELISA的结果显示,OA模型组的滑液中IL-1β的水平明显高于Control组。Ad-sh IRAK4的治疗可明显降低OA滑液中IL-1β的水平,且呈滴度依赖性。相似地,与Control组相比,OA模型组的滑膜液中TNF-α的水平也明显升高。Ad-sh IRAK4-H组可显著的降低OA滑液中TNF-α的水平。值得注意的是,Ad-sh IRAK4抑制滑膜组织中TLR/IL-1R信号转导。Ad-sh IRAK4显著降低滑膜组织中IRAK4、TRAF6、IL-1β的m RNA的表达和滑膜组织中IRAK4、TRAF6、TAK1、p-IKK、p-NFκB的蛋白表达。此外,免疫组化结果显示,OA模型组中,IRAK4、TRAF6、TAK1的表达高于Control组。而Ad-sh IRAK4降低了兔膝骨关节炎滑膜中IRAK4、TRAF6、TAK1的表达。OA模型组滑液中IL-1β、TNF-α、MMP-13水平明显高于Control组,Ad-sh IRAK4可降低OA模型组滑液中IL-1β、TNF-α、MMP-13水平。关节软骨的大体观和H＆E染色结果显示Ad-sh IRAK4可减轻兔膝骨关节炎模型软骨破坏。此外,免疫组化的实验结果显示,与Control组相比,在OA模型组和Ad-C组中,关节软骨中IRAK4蛋白阳性的细胞数量增加。而注射Ad-sh IRAK4后,IRAK4蛋白在关节软骨中的表达明显下降,差异具有统计学意义。Micro-CT分析显示,与OA模型组比,Ad-sh IRAK4的治疗可显著增加BV/TV与Tb.N。结论IRAK4参与了前交叉韧带切断术诱导的兔膝关节OA病变。Ad-sh IRAK4可减轻兔膝关节OA的滑膜炎,软骨破坏和软骨下骨微结构改变,从而限制或延迟OA的进展,因此,选择性抑制IRAK4可能是临床上OA防治的一种新的治疗策略。
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