【摘 要】
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目的: 研究子宫内膜癌细胞株Ishikawa细胞中过表达钙结合蛋白calbindin-d28k对卡铂诱导的凋亡及细胞迁移能力的影响。 方法: 1.构建钙结合蛋白calbindin-d28k基因的真
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目的: 研究子宫内膜癌细胞株Ishikawa细胞中过表达钙结合蛋白calbindin-d28k对卡铂诱导的凋亡及细胞迁移能力的影响。 方法: 1.构建钙结合蛋白calbindin-d28k基因的真核过表达载体GV230-CB及空载体GV230-Vec; 2.分别将质粒 GV230-CB/GV230-Vec转染至 Ishikawa细胞中,用该质粒抗性抗生素G418加压筛选,培养稳定过表达细胞株; 3.用MTT方法检测不同浓度的卡铂(0,4,16,32,64,128,256,512 ug/ml)作用40小时对Ishikawa细胞的抑制率,计算得出抑制率为50%的卡铂浓度IC50用于后面的相关实验; 4.用RT-PCR方法检测稳定转染GV230-CB/GV230-Vec质粒的Ishikawa细胞及卡铂作用40小时后的calbindin-d28k mRNA表达水平变化; 5.用Western-blot方法检测稳定转染GV230-CB/GV230-Vec质粒的子宫内膜癌细胞株 Ishikawa细胞及卡铂作用40小时后的calbindin-d28k、cleaved caspase-3蛋白水平表达变化情况; 6.用Hoechst33258染色法观察四种不同处理组Ishikawa细胞核变化情况,以此计算凋亡率; 7.用Transwell小室做迁移实验检测过表达calbindin-d28k蛋白的Ishikawa细胞的迁移能力变化情况。 结果: 1.使用抗生素 G418可筛选出稳定过表达 calbindin-d28k蛋白的Ishikawa细胞株,calbindin-d28k mRNA和蛋白水平均显著增高(P<0.05); 2.浓度为100ug/ml的卡铂作用于Ishikawa细胞40小时可诱导 Ishikawa细胞产生凋亡,同时凋亡执行蛋白cleaved caspase-3明显升高(P<0.05); 3.过表达calbindin-d28k蛋白的Ishikawa细胞可抑制卡铂诱导的凋亡作用,显著降低Ishikawa细胞中凋亡执行蛋白cleaved caspase-3的表达(P<0.05); 4.过表达 calbindin-d28k蛋白的Ishikawa细胞株的迁移力无明显变化(P>0.05)。 结论: 1.子宫内膜癌细胞株Ishikawa细胞中过表达calbindin-d28k蛋白可通过下调凋亡执行蛋白cleaved caspase-3而抑制卡铂诱导细胞产生的凋亡作用; 2.子宫内膜癌细胞株Ishikawa细胞中过表达calbindin-d28k蛋白对迁移能力无明显影响。
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