对虾加工过程中会产生大量的虾头副产物。虾头含有丰富的内源酶,酶活性高,易发生自溶。可利用内源酶的自溶作用回收虾头中的蛋白质等有用成分,也可提取内源酶制备生物酶制剂。前期研究发现经过UV-C照射胁迫可以促进虾头的自溶作用,主要由于其激活了内蛋白源酶,但其对内源蛋白酶的激活机制和对其他内源酶是否有激活作用尚不明确。本文在探究UV-C照射胁迫对凡纳滨对虾虾头主要内源酶激活效果的基础上,以其内源蛋白酶为研究对象,通过比较分析UV-C照射胁迫前后分离纯化的内源酸性、碱性蛋白酶在酶活影响因素、酶学性质、分子量及分子构象方面的差异性探讨其诱导凡纳滨对虾虾头内源蛋白酶激活的分子机制。主要研究结果如下:(1)以酶活力为评价指标,研究比较温度、p H对UV-C照射胁迫前后凡纳滨对虾虾头主要内源酶酶活的影响规律。结果表明:UV-C照射胁迫前后虾头内源酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和多酚氧化酶的最适p H和最适温度无明显变化,对脂肪酶和几丁质酶的最适p H有所改变,最适温度无显著影响。虾头内源酸性蛋白酶最适为p H 3,温度为60℃左右;虾头内源碱性蛋白酶最适的p H为8,温度为50℃左右;内源性几丁质酶最适的p H为5～6,温度为40℃左右;内源性脂肪酶最适为p H 10,温度为40℃左右;内源性多酚氧化酶最适为p H 8,温度25℃左右。UV-C照射胁迫对凡纳滨对虾虾头主要内源酶包括酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、脂肪酶、几丁质酶等均具有显著的激活作用。(2)以凡纳滨对虾虾头内源蛋白酶为研究对象,通过专一性抑制剂、无机离子等因素研究比较UV-C照射胁迫前后内源蛋白酶酶活的变化规律。结果表明:加入适当的Na Cl可使酶活提高,且UV-C照射胁迫前后的酶活变化趋相似;其最佳料液比为1:3。通过UV-C照射胁迫后虾头内源碱性蛋白酶酶活提高了42%,而加入专一性胰蛋白酶抑制剂的虾头内源碱性蛋白酶酶活仅提高5%;UV-C照射胁迫后虾头内源酸性蛋白酶酶活提高了59%,而加入专一性胃蛋白酶抑制剂的虾头内源酸性蛋白酶酶活显著提高了36%。以上说明虾头内源酸性蛋白酶中有类胃蛋白酶活性,虾头内源碱性蛋白酶中有较高的类胰蛋白酶活性。(3)通过硫酸铵分级沉淀,结合凝胶层析、离子交换层析、电泳等手段对UV-C照射胁迫前后的虾头内源蛋白酶进行分离纯化,对其高活性内源蛋白酶测定其分子量并进行同源性分析与鉴定。结果表明:UV-C照射胁迫处理前后虾头内源酸性蛋白酶最佳沉淀的硫酸铵浓度为70%,虾头内源碱性蛋白酶的最佳沉淀的硫酸铵浓度为60%。通过纯化后的虾头内源碱性蛋白酶的分子量约为23 k Da,虾头内源酸性蛋白酶的分子量约为32 k Da。虾头内源碱性蛋白酶同凡纳滨对虾的胰蛋白酶分子结构具有很高的同源性,具有类胰蛋白酶的性质;虾头内源酸性蛋白酶与天冬氨酸蛋白酶的分子结构具有很高的同源性,具有类胃蛋白酶的性质。(4)采用波谱解析手段探究UV-C照射胁迫对虾头内源蛋白酶空间构象的影响。结果表明:UV-C照射胁迫处理对于虾头内源碱性蛋白酶的二级结构变化不大,但是经过UV-C照射胁迫处理可能使得虾头内源碱性蛋白酶的空间构象适度展开,使得活性中心更易与蛋白底物结合,更易发挥其催化能力。虾头内源酸性蛋白酶经过UV-C照射胁迫处理经过圆二色谱分析可看出向β-折叠的低频区移动,经过荧光色谱分析UV-C照射胁迫处理后最大发射波长的峰位出现红移,红移跨度为10～25 nm。说明经过UV-C照射胁迫可能破坏了蛋白质分子中的氢键等各种次级键,进而破坏和改变蛋白的空间结构。在蛋白质变性过程中,芳香族氨基酸的分子侧链基团会逐渐暴露于水溶液里,其所处的环境极性增加,进而使其吸收峰增大。UV-C照射胁迫诱导内源蛋白酶空间构象的改变可能是其被激活的主要原因。UV-C照射胁迫可能使内源蛋白酶的空间构象适度展开,使得活性中心更易与蛋白底物结合,更易发挥其催化能力。