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内皮抑素(Endostatin,ES)是一个从小鼠体内血管内皮瘤的上清中被分离出来的相对分子质量为20 kD的内源性抗新生血管生成因子。ES可以抑制肿瘤部位血管的生成起到切断肿瘤营养供给和废物代谢途径的作用,目前在临床上应用于多种癌症的治疗。ES2(IVRRADRAAVP)是ES结构中一段具有抗新生血管生成活性的片段,其活性是ES完整序列的3倍。但ES2具有稳定性差和半衰期短等缺点,目前尚未实现临床应用。对蛋白质、多肽进行化学修饰是一种改善其缺点的有效方式。目前,最广泛使用的修饰剂是聚乙二醇(Polyethyleoe geycol,PEG)。PEG具有诸多优点,但是其不可降解性在长期、大量用药后是否会导致其他反应逐渐受到关注。壳寡糖(Chitosan oligosaccharide,COS)是一个结构明确、水溶性良好且具有一定抗肿瘤活性的多糖。本课题组前期采用季铵化壳寡糖(HTCOSC)对ES2进行体外修饰,得到的HTCOSC-ES2在保留抗新生血管生成活性的同时,水溶性、稳定性和细胞亲和力得到改善。本论文将进一步讨论HTCOSC-ES2如何作用于内皮细胞以及如何在体内发挥抗肿瘤作用;另外,对HTCOSC-ES2的体内药代动力学特征也进行了相关研究。本课题研究内容和取得的主要成果如下:I.HTCOSC-ES2的制备(1)季铵化基团接入到壳寡糖C6位的羟基后,经透析、冷冻干燥制得HTCOSC,产率为92.64%。经核磁共振氢谱(1HNMR)和红外光谱(IR)分析,HTCOSC结构符合预期。(2)以NHS/EDC为交联剂,通过ES2分子中的羧基与HTCOSC分子中的氨基形成酰胺键制备HTCOSC-ES2,并利用SephadexG-25凝胶层析进行分离纯化。(3)粒径和透射电子显微镜实验结果表明,在水相中ES2可形成外部为亲水性氨基酸、内部为疏水性氨基酸的纳米级球状结构;在水相中HTCOSC-ES2可形成外部为亲水性壳寡糖、内部为疏水性氨基酸的纳米级球状结构。2.HTCOSC-ES2体外抗内皮细胞增殖作用研究ES2和HTCOSC-ES2均可在体外显著抑制内皮细胞增殖且具有浓度依赖性,其中HTCOSC-ES2活性略强于ES2。当给药浓度分别为5/mL、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、1000μg/mL和125μg/mL时,ES2对内皮细胞增殖的抑制率分别为(3.50±1.85)%、(13.86±2.01)%、(25.89+5.83)%、(34.83±1.88)%、(33.24±3.38)%和(39.84±1.71)%;HTCOSC-ES2对内皮细胞增殖的抑制率分别为(14.86±3.76)%、(25.22士3.40)%、(37.50±3.65)%、(42.93±1.96)%、(43.60±1.53)%和(54.04±5.28)%。3.HTCOSC-ES2的内皮细胞摄取途径和在内皮细胞中的分布研究采用流式细胞术研究了FITC-ES2和FITC-HTCOSC-ES2的内皮细胞摄取途径。结果表明,内皮细胞可以通过网格蛋白和脂筏途径两种方式摄取ES2和HTCOSC-ES2,其中HTCOSC-ES2在内皮细胞的摄取以网格蛋白途径为主。采用激光共聚焦显微镜研究了FITC-ES2和FITC-HTCOSC-ES2在内皮细胞中的分布。结果表明,HTCOSC-ES2和ES2均经历了先进入溶酶体进而分布到细胞核的过程。HTCOSC-ES2进入溶酶体的时间略晚于ES2,0.5h时已经有部分ES2进入溶酶体,而HTCOSC-ES2开始进入溶酶体的时间为1 h;HTCOSC-ES2与ES2进入细胞核的时间相同,均为2 h时开始,3 h时完全进入细胞核。4.HTCOSC-ES2促内皮细胞凋亡作用和对内皮细胞周期的影响研究(1)通过流式细胞术研究了ES2、HTCOSC-ES2以及HTCOSC+ES2混合物促内皮细胞凋亡作用。结果表明,当与含有不同剂量的ES2、HTCOSC+ES2混合物和HTCOSC-ES2的培养基共同孵育时,内皮细胞均有一定程度的凋亡。但与空白对照及bFGF组相比,ES2组和HTCOSC+ES2混合物组(HTCOSC+ES2混合物高剂量组除外)的凋亡率未表现出明显不同(p>0.05)。HTCOSC-ES2结合物组的凋亡率呈现剂量依赖性,并且与其他各组相比,促凋亡作用具有显著差异(p<0.05)。当剂量分别为5μg、10μg、25μg和50μg时,HTCOSC-ES2结合物组的内皮细胞凋亡率分别为(14.13±0.45)%、(34.40±7.24)%、(51.77±5.23)%和(59.10±4.73)%。(2)采用流式细胞术研究了ES2、HTCOSC-ES2以及HTCOSC+ES2混合物对内皮细胞周期的影响。结果表明,当内皮细胞与含有不同剂量的ES2、HTCOSC+ES2混合物和HTCOSC-ES2的培养基共同孵育时,其细胞周期均受到了一定程度的影响。随给药剂量增加,各组G0/G1期的比例均有不同程度的增加,S期和G2/M期的比例也有不同程度的减少。其中,HTCOSC-ES2对内皮细胞周期的影响最明显,当给药剂量分别为5μg时,G0/G1期、S期和G2/M期的比例分别为(54.87±0.60)%、(44.77±0.51)%和(0.35±0.23)%;当给药剂量分别为10μg时,G0/G1期、S期和G2/M期的比例分别为(59.39±0.91)%、(39.24±1.91)%和(0±0)%;当给药剂量分别为25μg时,G0/G1期、S期和G2/M期的比例分别为(61.92±1.38)%、(37.52±2.10)%和(0.1±0.17)%;当给药剂量分别为50μg时,G0/G1期、S期和G2/M期的比例分别为(63.79±0.08)%、(36.12±0.66)%和(0±0)%。与空白对照或ES2组不同,HTCOSC-ES2可更显著地使大部分内皮细胞被阻滞在G1期,少部分进入S期,极少部分进入G2/M期。5.HTCOSC-ES2体内抗肿瘤作用及机制研究(1)研究了 ES2和HTCOSC-ES2体内对B16黑色素瘤的抑制活性。结果表明,ES2和HTCOSC-ES2在体内抑制B16黑色素瘤生长的效果显著。随着天数的增加,生理盐水组的肿瘤体积从(52.30±14.25)mm3增长到(3994.10±501.34)r)mm3,ES2组的肿瘤体积从(29.66±5.13)mm3增长到(2167.27±394.79)mm3,HTCOSC-ES2组的肿瘤体积从(28.62±4.78)mm3增长到(904.33±174.36)mm3,虽然各组肿瘤体积均不断增长,但HTCOSC-ES2组肿瘤体积的增长率远低于生理盐水组和ES2组。第15天处死小鼠后,HTCOSC-ES2组肿瘤重量为(2.58±0.77)g,显著低于生理盐水组的(8.10±2.30)g和ES2组的(5.24±0.41)geES2和HTCOSC-ES2组小鼠体重平稳,均未出现显著增加或降低,提示二者可能均具有较小的毒副作用。综上,ES2和HTCOSC-ES2可在体内显著抑制B16黑色素瘤的生长(p<0.05),其中HTCOSC-ES2具有显著高于ES2的肿瘤抑制率(p<0.05)。(2)免疫组化研究了HTCOSC-ES2和ES2对肿瘤生长相关因子表达的影响。结果表明,VEGF、CD31和caspase-3在生理盐水组、ES2组和HTCOSC-ES2组中均有表达,VEGF在生理盐水组、ES2组和HTCOSC-ES2组中的IOD值分别为(25.55±2.59)、(18.38±4.60)和(3.18±0.34);CD31在生理盐水组、ES2组和 HTCOSC-ES2 组中的 IOD值分别为(30.00±5.69)、(17.86±3.34)和(10.43±2.88);caspase-3在生理盐水组、ES2组和HTCOSC-ES2组中的IOD表达分别为(10.56±2.06)、(53.48±11.00)和(347.14±155.33)。免疫组化研究分析表明,ES2和HTCOSC-ES2均可显著降低血管生成因子VEGF的表达和肿瘤附近微血管的密度(p<0.05),并提高肿瘤中凋亡蛋白caspase-3的表达,其中HTCOSC-ES2组caspase-3表达的升高具有统计学意义(p<0.05)。ES2和HTCOSC-ES2通过降低VEGF和增加caspase-3的表达来抑制肿瘤附近微血管密度和新血管的形成,进而抑制肿瘤的生长;ES2的HTCOSC修饰保留并提高了ES2抗新生血管生成、抗肿瘤的作用,其疗效符合预期结果。6.HTCOSC-ES2药代动力学和组织分布研究(1)本课题选用C57BL/6实验鼠作为体内药物代谢动力学模型,通过TCA沉淀蛋白的方法处理血浆和组织来研究半衰期等药代动力学参数和组织分布。通过比较ES2和HTCOSC-ES2的药代动力学参数发现,ES2经过化学修饰后,结合物HTCOSC-ES2的半衰期tl/2由(18.04±2.38)h延长至(29.17±3.91)h,药时曲线下面积AUC 由(226.67±95.20)μg/L*h增加至(11650.98±129.41)μg/L*h,最大血浆浓度Co也由(277.83±121.86)μg/L增大到(1931.81士75.35)μμg/L,血浆清除率CL由(90.26±39.94)L/h/kg下降至(10.32±0.89)L/h/kg,这说明结合物HTCOSC-ES2达到了降低其血浆清除率和延长半衰期的目的。(2)组织分布的研究结果表明,ES2和HTCOSC-ES2主要分布在肝脏和肾脏。ES2和HTCOSC-ES2在肝脏的分布均可在2h达到最大,且HTCOSC-ES2在肝脏的聚集作用比ES2更明显。此外ES2和HTCOSC-ES2也以较低的浓度分布在其他组织中。综上,ES2和HTCOSC-ES2主要通过网格蛋白和脂筏途径被内皮细胞摄取,通过溶酶体降解后转运到细胞核中促进内皮细胞凋亡和抑制细胞G0/G1期的进程,进而抑制新生血管生成。HTCOSC-ES2可促进肿瘤组织凋亡蛋白caspase-3的增加以及微血管密度和VEGF表达的降低,导致肿瘤中微血管数量的减少进而有效抑制肿瘤的生长。另外,与ES2相比,HTCOSC-ES2获得了更长的内皮细胞摄取时间和体内半衰期,并表现出一定的肝脏聚集效应。本研究的开展,为将HTCOSC-ES2开发成为新生血管生成相关疾病的治疗药物奠定研究基础。