细胞通透化处理对苯乳酸生产的影响

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苯乳酸(PLA)是一种天然广谱食品防腐剂,具有稳定性好溶解性强等优点。之前研究中以重组大肠杆菌E.coli BL21(p RSFDuet-2ldh-rbs2aad-fdh)为细胞催化剂,通过静息细胞转化将苯丙氨酸(PHE)转化为PLA,使PLA产量达到43.8 g/L。然而PLA合成过程中,仍然存在15.2 g/L的中间产物苯丙酮酸(PPA)累积,底物摩尔转化率仅为78.7%。本文为了提高PLA产量和底物摩尔转化率,首先,采取物理方法制备通透化细胞进行静息细胞转化,经过四种物理方法(干燥法、冻融法、超声法和渗透压冲击法)透化细胞后相关实验数据的对比,确定应选用超声法。紧接着,优化超声法的通透条件,确定最优超声处理时间、占空比和功率。然后,在该条件下进一步优化细胞通透化后静息细胞转化的条件,确定最优底物(PHE、甲酸铵)浓度、PH、温度和缓冲液体系。最后,通过检测通透化细胞胞内胞外PHE、PPA和PLA的浓度变化以及静息细胞的通透性变化,讨论了超声处理对静息细胞回收利用的影响,分析了超声法制备通透化细胞提高转化效率的机理。另外,通过比较,发现添加共底物(葡萄糖、甘油和酵母提取物)可以进一步提高苯乳酸的产量。主要研究结果如下:(1)利用干燥法、冻融法、超声法和渗透压冲击法制备通透化细胞,菌体回收率最高分别为82.23%、92.37%、81.77%、41.36%,静息细胞转化PLA产量最高分别为6.24 g/L、10.75 g/L、12.44 g/L、5.36 g/L,结合四种方法不同梯度产量变化趋势,选用超声处理法制备通透化细胞。(2)通过扩大培养制得静息细胞后,优化超声通透化条件,确定最优超声通透化处理条件为处理时间1 min、占空比80%、功率30%。应用最优超声处理制备通透化细胞,当缓冲液体系中细胞催化剂量为30 g/L,补料为30 g/L PHE和5 g/L AMF时,静息细胞转化使PLA产量达到20.65 g/L。(3)应用上步筛选的最优超声处理条件制备通透化细胞,优化通透化细胞催化条件,确定最优催化条件为:底物PHE浓度为60 g/L,且甲酸铵与PHE摩尔质量比为1.5,PH为7,35 oC,PBS缓冲液。应用此最佳催化条件,使中间产物PPA积累PLA的产量达到52.62 g/L,底物转化率为87.7%。(4)从催化过程中超声处理对通透化细胞内外PHE、PPA和PLA浓度变化,静息细胞通透性变化,通透化细胞稳定性变化,分析超声通透化作用提高PLA转化效率的机理,发现超声处理通过提高细胞膜通透性,增强细胞吸收利用底物的能力促进中间产物转化,增强L-氨基酸脱氨酶(L-AAD)、乳酸脱氢酶(LDH)和甲酸脱氢酶(FDH)的催化能力,提高整个反应的催化效率。(5)比较在催化过程中添加共底物葡萄糖、甘油和酵母提取物和未添加对照组的细胞稳定性和PLA产量变化,通过比较,发现葡萄糖是最佳共底物,添加葡萄糖使PLA产量增加7.1%(从52.62 g/L增至56.36 g/L)。
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