【摘 要】
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研究背景:支气管哮喘是一种复杂的气道炎症性疾病,由多种细胞及细胞组分参与,发病率居高不下。核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族含结构域蛋白3（NOD-like Receptor with Pyrin Domain Containing 3,NLRP3）,是最经典的模式识别受体之一,能够被多种刺激如过敏原所激活,参与哮喘的发生发展。氧化应激是由于氧化物如活性氧（Reactive oxygen speci
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研究背景:支气管哮喘是一种复杂的气道炎症性疾病,由多种细胞及细胞组分参与,发病率居高不下。核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族含结构域蛋白3（NOD-like Receptor with Pyrin Domain Containing 3,NLRP3）,是最经典的模式识别受体之一,能够被多种刺激如过敏原所激活,参与哮喘的发生发展。氧化应激是由于氧化物如活性氧（Reactive oxygen species,ROS）、活性氮（Reactive nitrogen species,RNS）等的产生与抗氧化防御能力之间的失衡而致,与哮喘的炎症反应密切相关。研究报道,Toll样受体9（Toll-like 9 receptor,TLR9）在哮喘发病机制中发挥十分关键的作用,然而具体机制仍有待阐明。目的:本研究通过构建卵清蛋白（Ovalbumin,OVA）诱导的过敏性气道炎症模型并以Raw264.7巨噬细胞为研究对象,探讨TLR9在过敏性气道炎症和Raw264.7细胞中的作用及其与NLRP3炎症小体及氧化应激的关系。材料与方法:1.体内实验:5周龄雌性野生型和TLR9-/-（C57 BL/6）小鼠随机分为四组:对照组（Vehicle）、OVA组（OVA）、TLR9-/-对照组(TLR9-/-Vehicle)、TLR9-/-OVA组(TLR9-/-OVA),每组6只。OVA组和TLR9-/-OVA组于第0天腹腔注射500 ul经铝剂乳化的OVA（10 ug）溶液,从第14天开始,雾化OVA,连续四天,每天30分钟。最后一次雾化结束24小时后取材,留取肺泡灌洗液（BALF）和肺组织。血球计数板用于肺泡灌洗液白细胞总数计数,瑞氏吉姆萨染色进行细胞分类计数,酶联免疫吸附法（ELISA）检测肺泡灌洗液中IL-1β、IL-18、IL-5和GM-CSF的水平。蛋白印迹法检测肺组织中TLR9、NLRP3、IL-1β、caspase-1（p20）、硝基酪氨酸的相对表达水平。HE染色评估肺组织中气道周围炎症细胞浸润情况,PAS染色观察杯状细胞增生及粘液分泌,免疫组织化学检测肺组织中硝基酪氨酸和8-羟基-脱氧鸟苷（8-OHd G）的蛋白表达水平。2.体外实验:小鼠巨噬细胞系Raw264.7,分为对照组（control）,金葡菌组（S.aureus）及TLR9 si RNA处理组（S.aureus+TLR9 si RNA）,金黄色葡萄球菌处理8 h后,western blot检测各组细胞中TLR9、NLRP3、IL-1β、caspase-1（p20）、硝基酪氨酸的相对表达水平,ELISA检测培养基中IL-1β和IL-18的含量,免疫荧光法检测细胞中硝基酪氨酸和8-OHd G的表达水平,Mito SOX Red试剂盒检测细胞内活性氧水平。结果:1.在体内实验:与野生型小鼠相比,TLR9缺失明显抑制了OVA所诱导的小鼠肺组织中炎症细胞的浸润和杯状细胞的增生,降低了肺泡灌洗液中白细胞总数及分类计数及肺泡灌洗液中IL-1β、IL-18、IL-5、GM-CSF细胞因子的产生,同时也抑制了NLRP3炎症小体、IL-1β、IL-18、caspase-1、硝基酪氨酸、8-OHd G蛋白的表达及线粒体氧化应激水平的增加。2.在体外实验:与对照组相比,金葡菌能够诱导Raw264.7巨噬细胞中NLRP3炎症小体的活化,促使NLRP3、IL-1β、IL-18、caspase-1的表达增加,且细胞中氧化应激标记物如硝基酪氨酸和8-OHd G以及线粒体超氧阴离子水平增加。而使用si RNA下调TLR9后,金黄色葡萄球菌刺激所致上述蛋白和超氧阴离子水平的增加则被明显抑制。结论:TLR9介导OVA诱导的小鼠过敏性气道炎症中NLRP3炎症小体的激活和氧化应激的上调。TLR9参与调节Raw264.7细胞中NLRP3炎症小体的活化及氧化应激。在过敏性气道炎症中,TLR9可能是激活NLRP3炎症小体及氧化应激的关键调节介质。
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