小分子捕获(Small Molecular Trapping,SMT)技术是利用基因工程手段改造捕获酶,降低其对底物或待测小分子的催化、分解活性,但保留或增强其对底物或待测小分予物质的亲合力,然后采用和“竞争免疫”类似的“竞争结合”方法检测小分了的含量。氯霉素乙酰转移酶是一种原核酶类,可以将氯霉素乙酰化而使其失活,是细菌产生氯霉素抗性的主要原因。在大肠杆菌中易表达,而且非常稳定,因此,氯霉素乙酰转移酶可被改造成检测氯霉素的理想工具酶。 不同种类的抗性细菌可以产生不同种类的氯霉素乙酰转移酶,其中以CAT Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ研究的最多,这三者中又以CAT Ⅰ对底物的亲合性为最高。结构研究表明位于催化中心的组氨酸对酶的催化活性有很大的影响,将组氨酸突变为丙氨酸,可以使酶的催化活性大大下降(Kcat下降9×10~5倍)而对结合活性的影响却很小。本课题通过参考当前关于CAT酶的结构和功能研究进展,利用基因工程手段对野生型cat基因进行定点突变,使其蛋白产物催化活性丧失而结合活性基本不变,并构建重组载体转化大肠杆菌,得到了可高效稳定表达的重组菌株。而且由于表达出来的氯霉素乙酰转移酶NH2基端带了可和Ni柱结合的His Tag序列,简化了纯化工艺,大大降低了成本。本文最后对酶的“竞争性ELISA曲线”进行了初步探索,证明突变型氯霉素乙酰转移酶应用于检测氯霉素是可行的,同时也为构建新型的氯霉素检测试剂盒提供了一种新的思路。