【摘 要】
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作为一种能在油水界面上催化酯水解和酯合成的界面酶,脂肪酶在均一水相中催化通常表现酶活力较低以及稳定性差的缺点。因此非纯水相体系中脂肪酶的催化及其固定化的研究具有重要意义。低共熔溶剂（Deep eutectic solvent,DES）是近年来发现的一种新型的富含氢键的离子液体,具有热稳定性与化学稳定性良好,生物亲和性高和使用成本低等特点,可以用于脂肪酶的非水相合成与催化。本论文以米曲霉CJLU-3
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作为一种能在油水界面上催化酯水解和酯合成的界面酶,脂肪酶在均一水相中催化通常表现酶活力较低以及稳定性差的缺点。因此非纯水相体系中脂肪酶的催化及其固定化的研究具有重要意义。低共熔溶剂（Deep eutectic solvent,DES）是近年来发现的一种新型的富含氢键的离子液体,具有热稳定性与化学稳定性良好,生物亲和性高和使用成本低等特点,可以用于脂肪酶的非水相合成与催化。本论文以米曲霉CJLU-31脂肪酶（AOCL）为模型酶,研究了DES/水双相体系在脂肪酶催化与固定化过程中的作用,并分别考察了游离脂肪酶在DES/水双相体系中的酶学性能,DES/水双相体系中制备脂肪酶杂化磷酸钙复合物（AOCL@Ca P in DES）及其催化性能和在生物柴油中的应用。主要研究内容如下:1.将DES/水的双相体系用于在脂肪酶催化反应过程,考察了水相体系和DES/水双相体系中脂肪酶的催化性能。相比其他低共熔溶剂,脂肪酶在氯化胆碱:甘油（ChCl:Gly,简写C-Gly）与水的双相体系中酶活力表现最好,并且当体系中水的比例为20%时脂肪酶酶活力可达280%。双相体系中脂肪酶的催化性能研究表明,在70 oC热处理30 min后,在20%的C-Gly/水双相体系中AOCL可保持91%的酶活残留率,但水相中的脂肪酶仅剩27%的酶活残留率,表明脂肪酶在双相体系中具有更高的热稳定性;而且,相比于水相,在双相体系中的脂肪酶也表现出更好的变性剂耐受性和储存稳定性。脂肪酶在两种体系中的动力学参数表明,在C-Gly/水双相体系中脂肪酶具有对长链酯更好的亲和性。2.基于酶-无机杂化纳米技术在低共熔溶剂/水的双相体系中脂肪酶杂化磷酸钙复合物（AOCL@Ca P in DES）的制备及其催化性能的考察。优化了制备条件:在含水量10%的ChCl:Gly/水双相体系中,Ca2+终浓度为40 m M、PO43-终浓度为15 m M和脂肪酶浓度0.01 mg/m L的条件下,所制备的AOCL@Ca P in DES酶活回收率为145%,但是在相同条件下水相体系中制备的AOCL@Ca P酶活回收率仅为78%。经过测定催化性能发现,双相体系中制备的AOCL@Ca P in DES的温度稳定性、变性剂耐受性、酶的底物选择性以及重复使用性能均优于水相中制备的AOCL@Ca P。双相体系中AOCL@Ca P in DES组装过程研究表明,水是以液滴的形式悬浮在Ch Cl:Gly/水双相体系中,脂肪酶的自组装过程发生在液滴的表面,对脂肪酶产生了界面激活的作用。圆二色谱检测表明在Ca2+和DES的协同作用下脂肪酶二级结构发生了变化,α-helix减少,β-sheet增多。分子模拟结果进一步表明,β-sheet含量的增多可以使脂肪酶分子内部的氢键数增多,进而提高酶的刚性和稳定性,同时氢键的增多也可拉近活性区域残基间距,增大了底物进入酶分子内部与活性中心接触的机会。3.双相体系中制备的AOCL@CaP in DES在低共熔溶剂/水双相催化体系转化生物柴油。优化了AOCL@CaP in DES在DES/水双相体系转化生物柴油的条件,在氯化胆碱:山梨醇（C-DS）溶剂:水:油（v/v）=5:1:1的双相体系中,AOCL@Ca P in DES添加量为10%,醇油比为20:1,搅拌转速为300 rpm、反应温度为45 oC,反应时间为19 h的条件下,AOCL@Ca P in DES催化大豆油转酯化得到生物柴油的产率可达87%,在重复使用10次后产率保持在50%,这一应用性能优于水相中制备的AOCL@CaP（40%）和Novozyme 435（1%）。
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