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背景:青光眼滤过性手术(Glaucoma filtration surgery,GFS)是目前临床治疗青光眼眼压(intraocular pressure,IOP)控制不佳的有效方法,但术后结膜囊瘢痕的发生常导致手术失败。尽管,临床上5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)、丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)能提高了滤过性手术的成功率,但仍存在一些严重并发症,例如滤过泡的渗漏、术后浅前房以及角膜毒性等。因此,寻求一种有效且安全的抗瘢痕药物仍是目前研究的重点。有文献指出氧化与抗氧化平衡通过不同的途径调节TGF-bs诱导的纤维化,并表明氧化应激的增加对纤维化疾病的发展至关重要。因此,针对TGF-bs诱导的和ROS依赖的细胞氧化应激反应,可能为纤维化疾病的治疗提供新的方法。在前期研究中,本课题组利用指数式富集的配基系统进化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)技术,筛选并优化出具有靶向TbR II、无毒性、易化学修饰的核酸适配子S58。S58阻抑TGF-b2与其受体结合是否能够改善细胞内应激水平,调节氧化-抗氧化失衡抑制青光眼滤过性手术术后瘢痕仍有待进一步阐述。目的:本研究拟通过在体内/外的实验验证靶向TbR II的核酸适配子S58阻抑TGF-b2促纤维化的生物学作用,并进一步研究S58改善受损结膜囊成纤维细胞内氧化-抗氧化稳态抑制青光眼滤过性手术术后瘢痕的作用机制。方法:(一)体外实验部分:原代人结膜囊成纤维细胞(Human Conjunctival Fibroblasts,HConFs)用于细胞实验。1.运用软件建立核酸适配子S58的三维模型,构建S58与TbR II胞外段的三维晶体结构,然后对S58和TbR II进行半柔性分子对接,统计分析S58和TbR II的结合情况,并确定其结合位点。2.流式细胞仪技术检测和激光共聚焦显微镜观察荧光标记后的核酸适子S58与成纤维细胞的结合情况,并利用siRNA-TbR II敲低实验来验证S58靶向TbR II抗TGF-b2诱导的纤维化。3.不同浓度的TGF-b2(0、1、2、4、10、20 ng/m1)处理HConFs细胞24 h,或HConFs在TGF-b2(4 ng/m1)诱导不同时间(0、24、48、72 h)后,应用Western blot或RT-PCR检测细胞纤维化相关蛋白或基因的表达;共聚焦细胞免疫荧光技术检测α-SMA表达水平。4.NAC处理TGF-b2(4 ng/m1)诱导的HConFs 24h,应用Western blot或RT-PCR检测细胞纤维化和相关抗氧化蛋白或基因的表达;共聚焦细胞免疫荧光技术检测α-SMA、collagen-1表达水平。5.S58处理TGF-b2(4 ng/m1)诱导的HConFs 24h,应用Western blot或RT-PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction)检测相关抗氧化蛋白或基因的表达;流式细胞仪技术检测细胞内ROS水平。6.S58处理TGF-b2(4 ng/m1)诱导的HConFs 24h,应用Western blot或RT-PCR检测细胞纤维化相关蛋白或基因的表达;共聚焦细胞免疫荧光技术检测α-SMA、collagen-1、fibronectin表达水平,划痕实验和CCK-8实验用于评价S58对TGF-b2诱导的HConFs增殖和迁移的影响。7.利用siRNA-Nrf2的基因敲除或LY294002对PI3K/Akt的抑制,通过应用Western blot和共聚焦细胞免疫荧光技术检测细胞纤维化相关蛋白的表达,来验证S58对TGF-b2诱导的HConFs抗纤维化影响;(二)动物实验部分:以新西兰兔眼青光眼滤过性手为模型,研究S58抑制术后滤过泡纤维化的治疗效果。1.制作新西兰兔青光眼滤过性手术模型,实验分组分别为:Normal组;Sham组;S58组:S58 20nM/drop(4次/天);MMC组:MMC(0.2mg/m1)。2.分别于术后3 d、1 w、2 w、4 w观察兔子眼滤过泡的形态,裂隙灯下观察并拍照记录以及测量IOP变化。3.病理组织石蜡切片及H&E、Masson、天狼猩红染色分析。结果:1.S58能够通过增加TGF-b2与TbR II结合位阻来抑制TGF-b2诱导的HConFs纤维化。2.TGF-b2诱导HConFs细胞内氧化应激反应和增加纤维化水平。3.TGF-b2增加HConFs氧化应激和诱导纤维化。4.NAC通过抑制ROS的产生降低TGF-b2诱导的HConFs纤维化,提示ROS在TGF-b2诱导HConFs纤维化中扮演着重要的角色。5.S58促进TGF-b2诱导的HConFs抗氧化防御能力。6.S58减少TGF-b2诱导的HConFs纤维化。7.S58逆转TGF-b2诱导的HConFs纤维化通过激活PI3k/Akt/Nrf2信号通路。8.以青光眼滤过性手术的新西兰兔为模型,S58可有效降低滤过性手术术后滤过泡的纤维化程度而延长滤过泡存在时间。结论:本研究提示S5(23)可通过激活细胞内抗氧化防御PI3k/Akt/Nrf2信号通路改善青光眼滤过性手术预后。