研究背景 肺癌（lungcancer）是世界范围内最常见的癌症相关死亡原因。大约85%的肺癌确诊病例被归类为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）,其中肺腺癌（lungadenocarcinoma,LUAD）是最主要的组织学亚型。尽管目前手术切除、铂类药物治疗和放射治疗等方法取得了不少成果,但由于肺腺癌患者就诊时常处于晚期,且复发转移率高,多数患者的预后仍不令人满意。因此,从分子水平探索肺腺癌发生和发展过程中的基因改变及作用机制,有助于找到发现新的诊断标志物和潜在的治疗靶点。FK506结合蛋白（FK506-binding proteins,FKBPs）属于免疫亲和素蛋白家族,因可以与免疫抑制药物FK506结合而得名。除了在免疫抑制中发挥作用外,FKBPs还参与许多细胞过程,如蛋白质运输、转录调控、蛋白折叠、信号转导等。其特征性结构域为肽基脯氨酸异构酶（peptidyl prolyl isomerase,PPIase）结构域,该结构域位于FKBPs的N末端,由FKBP12样结构域1和2（FKBP12-like domains 1 and2,FK1和FK2）组成。只有FK1结构域可以与免疫抑制药物FK506和雷帕霉素结合,具有PPIase酶活性。FK2结构域对整体结构起着重要作用。该家族中分子量较高的成员,如FKBP4和FKBP5,C末端具有三个肽重复序列（tetratricopeptide repeat,TPR）结构域,能够与分子伴侣Hsp90结合并参与蛋白质-蛋白质相互作用。FKBP4作为分子伴侣复合物的组成部分,可以调节类固醇受体的活性,如雌激素受体、孕激素受体以及雄激素受体。这对于性激素依赖的乳腺癌和前列腺癌的发生发展尤为重要。据报道,FKBP4可以通过增强Akt信号通路促进三阴性乳腺癌患者的细胞增殖,这提示FKBP4对该类乳腺癌的调控并非依赖甾体激素受体信号通路。FKBP4除与生殖系统肿瘤相关外,在肝癌中也发挥重要作用,其在肝癌组织中表达升高,但具体作用机制尚未研究。值得注意的是,在293T细胞中,FKBP4可以与RelA结合促进核因子κB（Nuclear factor-κB,NF-κB）的转录活性。NF-κB作为关键转录因子功能涉及炎症反应、肿瘤发生、免疫反应以及细胞生存等多种生理病理过程。在许多肿瘤包括肺癌中都能看到NF-κB信号通路的激活,该通路的活化有利于肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。在细胞静息状态下,NF-κB二聚体与IκBs（NF-κB抑制因子）结合存在于胞浆中。在经典途径中,当细胞受到TNF-α、IL-1等因子刺激时,IκB激酶复合物（IκB kinase complex,IKK complex）会发生磷酸化,继而磷酸化IκBα蛋白Ser32/36位点,导致其被蛋白酶体降解。解离下来的NF-κB二聚体,主要是RelA:p50二聚体,入核并介导下游靶基因的转录。研究目的 在本研究中,我们旨在通过生物信息学分析、临床病理研究、建立细胞及小鼠肺腺癌实验模型,深入探究FKBP4在肺腺癌进展中的作用及分子机制,为肺腺癌的临床辅助诊断及靶向治疗提供新思路。第一部分FKBP4在肺腺癌中的表达及其临床意义研究方法1.生物信息学分析 通过TCGA和Oncomine数据库分析FKBP4 mRNA在肺腺癌组织及正常肺组织的表达情况。通过TCGA数据库分析FKBP4 mRNA表达与肺腺癌患者临床病理参数的相关性。通过TCGA数据库和Kaplan-Meier plotter生存期分析软件分析FKBP4 mRNA表达与肺腺癌患者预后的相关性。2.免疫组织化学染色（Immunohistochemistry,IHC）通过免疫组化染色的方法,检测FKBP4蛋白在94例肺腺癌组织及86例癌旁组织中的表达情况,分析FKBP4蛋白表达与肺腺癌患者临床病理特征及与患者预后的相关性。研究结果1.生物信息学分析TCGA和Oncomine数据库分析结果显示,FKBP4mRNA在肺腺癌组织中的表达与正常肺组织相比显著升高。TCGA数据库分析结果显示,FKBP4mRNA表达与患者性别、肿瘤大小及TNM分期显著相关。TCGA数据库和Kaplan-Meier plotter在线生存期分析软件结果显示,高表达FKBP4 mRNA的患者与低表达患者相比生存时间明显缩短。2.免疫组织化学染色与正常肺组织相比,FKBP4蛋白在肺腺癌组织中的表达显著升高。FKBP4蛋白表达与肺腺癌患者临床病理分级、TNM分期显著相关。高表达FKBP4蛋白的患者与低表达患者相比,生存时间显著缩短。结论 FKBP4在肺腺癌组织中表达升高,且高表达FKBP4的患者预后较差。第二部分 FKBP4对肺腺癌生物学行为的影响研究方法1.细胞转染 在H1975和PC9两种肺腺癌细胞中转染FKBP4小干扰RNA,构建FKBP4瞬时敲减的肺腺癌细胞模型。在BEAS-2B永生化的正常肺上皮细胞中转染FKBP4过表达质粒,构建FKBP4瞬时过表达的细胞模型。在H1975和PC9肺腺癌细胞中转染FKBP4敲减慢病毒,构建FKBP4稳定敲减的肺腺癌细胞模型。2.Western blot实验 通过Western blot实验检测FKBP4敲减或过表达情况。通过该实验检测FKBP4对细胞周期相关蛋白CyclinD1、CDK6,侵袭相关蛋白MMP9,增殖相关蛋白c-Myc表达情况的影响。3.CCK-8和克隆形成实验 通过CCK-8和克隆形成实验检测FKBP4对肺腺癌细胞体外增殖能力的影响。4.细胞周期实验 通过流式细胞周期实验检测FKBP4对肺腺癌细胞周期的影响。5.Transwell迁移和侵袭实验 通过Transwell迁移和侵袭实验检测FKBP4对肺腺癌细胞体外迁移和侵袭能力的影响。6.裸鼠皮下成瘤实验 通过裸鼠皮下成瘤实验检测FKBP4对肺腺癌细胞体内增殖能力的影响。7.裸鼠尾静脉注射实验 通过裸鼠尾静脉注射实验检测FKBP4对肺腺癌细胞体内转移能力的影响。研究结果1.下调FKBP4表达抑制肺腺癌细胞体外增殖及迁移、侵袭能力CCK-8和克隆形成实验结果显示FKBP4表达降低可以抑制肺腺癌细胞的体外增殖及克隆形成能力,细胞周期实验结果显示FKBP4敲减后细胞处于G0/G1期的比例明显增多,处于G2/M期的比例明显减少,这表明FKBP4表达降低可以通过诱导细胞周期阻滞来抑制细胞增殖。Transwell迁移和侵袭实验结果显示FKBP4表达降低可以抑制肺腺癌细胞的体外迁移、侵袭能力。2.上调FKBP4表达促进正常肺上皮细胞体外增殖及迁移、便袭能力CCK-8和克隆形成实验结果显示FKBP4表达升高可以促进正常肺上皮细胞的体外增殖及克隆形成能力,细胞周期实验结果显示FKBP4过表达后细胞处于G0/G1期的比例明显减少,处于G2/M期的比例明显增多,这表明FKBP4表达升高可以通过加快细胞周期进程来促进细胞增殖。Transwell迁移和侵袭实验结果显示FKBP4表达升高可以促进正常肺上皮细胞的体外迁移、侵袭能力。3.下调FKBP4表达抑制肺腺癌细胞体内增殖及转移能力裸鼠皮下成瘤实验结果显示FKBP4敲减组裸鼠皮下肿瘤生长速度及瘤重明显低于对照组,这表明FKBP4表达下降可以抑制肺腺癌体内成瘤能力。裸鼠尾静脉注射实验结果显示FKBP4敲减组肺转移灶的大小及数量明显低于对照组,表明FKBP4表达下降可以抑制肺腺癌体内转移能力。结论 FKBP4通过加快细胞周期进程来促进肺腺癌细胞增殖,且FKBP4能够增强肺腺癌细胞的迁移和侵袭能力。第三部分FKBP4上调NF-κB信号通路促进肺腺癌进展的相关机制研究研究方法1.转录组测序（RNA sequencing,RNA-seq）通过转录组测序检测FKBP4敲减后的基因表达谱变化,筛选富集通路。2.BioID及质谱技术 通过BioID及质谱技术筛选FKBP4相互作用蛋白。3.双荧光素酶报告基因实验 通过双荧光素酶报告基因实验检测FKBP4对NF-κB转录活性的影响。通过该实验检测FKBP4是否通过IKKβ促进NF-κB转录活性。通过该实验检测FKBP4与Hsp90/IKK复合物的结合是否能促进NF-κB转录活性。通过该实验检测FKBP4是否通过RelA促进NF-κB转录活性。4.免疫共沉淀实验（Co-immunoprecipitation,Co-IP）通过Co-IP实验检测FKBP4与Hsp90、IKKα/β/γ的内源性及外源性相互作用。通过该实验检测FKBP4对Hsp90与IKK相互结合的影响。通过该实验检测FKBP4对IKK复合物装配的影响。通过该实验明确FKBP4与IKKβ/γ相互结合的结构域。5.GST pull-down 实验 通过 GST pull-down 实验检测 FKBP4 与 Hsp90、IKKα/β/γ的体外相互作用。通过该实验检测FKBP4与Hsp70、RelA的体外相互作用。6.细胞免疫荧光 通过细胞免疫荧光实验检测FKBP4与RelA的共定位情况。7.Western blot实验 通过Western blot实验检测FKBP4对NF-κB通路蛋白表达情况的影响。研究结果1.FKBP4通过FKBP4/Hsp90/IKK 复合物促进NF-κB信号通路及转录活性1.1 FKBP4通过IKKβ促进NF-κB信号通路及其转录活性RNA-seq结果显示FKBP4表达下调抑制了 IKK/NF-κB信号通路及其转录活性。Western blot结果显示FKBP4能够促进IKK/NF-κB通路关键蛋白IKKα/β、IκBα、RelA的磷酸化。双荧光素酶报告基因实验结果显示FKBP4能够增强NF-κB 转录活性,且 FKBP4 能增强 IKKβ 诱导的 NF-κB 转录活性。这些结果表明FKBP4可以通过IKKβ促进NF-κB信号通路及其转录活性。1.2 FKBP4与Hsp90、IKK复合物的结合质谱结果显示FKBP4可以与IKK磷酸化所需的Hsp90结合。Co-IP实验结果证实FKBP4可以与Hsp90及IKK各亚基发生外源性及内源性结合。GST pull-down实验结果显示FKBP4可以与Hsp90、IKKβ、IKKγ亚基结合,不能与IKKα亚基结合。这些结果说明FKBP4可以与Hsp90、IKKβ/γ结合,与IKKα的结合是由IKKβ/IKKγ/Hsp90 介导的。1.3 FKBP4增强Hsp90/IKK的结合并促进IKK复合物的装配Co-IP实验结果显示FKBP4表达降低,Hsp90与IKK的内源性及外源性结合减少;FKBP4表达升高,Hsp90与IKK的内源性结合增多,这表明FKBP4能增强Hsp90与IKK的相互结合。Co-IP实验结果显示FKBP4表达降低,IKKβ和IKKγ的结合减少,这表明FKBP4可以促进IKK复合物的装配。1.4 FKBP4通过TPR结构域IKK复合物结合,且该结合依赖结合依赖Hsp90的存在Co-IP实验结果显示FKBP4 TPR结构域缺失后失去与Hsp90、IKKβ、IKKγ结合的能力,FKBP4PPIase结构域缺失后与IKKγ结合的能力明显下降。这表明FKBP4通过TPR结构域与IKK复合物结合,且PPIase结构域有利于FKBP4与IKKγ的结合。Co-IP实验结果显示FKBP4发生K354A点突变,即不能与Hsp90结合时,FKBP4失去与IKKβ、IKKγ结合的能力,这说明FKBP4与IKK复合物的结合依赖Hsp90的存在。1.5 FKBP4与Hsp90/IKK复合物的结合可以增强NF-κB转录活性双荧光素酶报告基因实验结果显示FKBP4与Hsp90/IKK复合物的结合能增强NF-κB转录活性,且破坏该结合后未能完全逆转NF-κB转录活性,这表明FKBP4对NF-κB转录活性的调控可能还存在其他机制。2.FKBP4通过FKBP4/Hsp70/RelA促进NF-κB信号通路及其转录活性2.1 FKBP4通过RelA促进NF-κB转录活性双荧光素酶报告基因实验结果显示FKBP4表达降低抑制RelA诱导的NF-κB 转录活性;FKBP4 表达升高促进 RelA 诱导的 NF-κB 转录活性。这表明 FKBP4还可以通过RelA促进NF-κB转录活性。2.2 FKBP4促进NF-κB核转位及下游靶蛋白表达Western blot实验结果显示FKBP4能促进RelA核转位,并且能促进NF-κB下游靶蛋白MMP9、c-Myc、CyclinD1和CDK6的表达。2.3 FKBP4 与 Hsp70、RelA 的结合细胞免疫荧光结果显示加入NF-κB激活剂TNF-α因子后,FKBP4与RelA共定位增加,这说明二者在核内可能存在相互作用。GST pull-down实验结果显示FKBP4可以与Hsp70、RelA发生体外结合。Co-IP实验结果显示FKBP4可以与内源性Hsp70、RelA结合。3.FKBP4通过上调NF-κB信号通路促进细胞侵袭Transwell侵袭实验结果显示FKBP4可以通过增强NF-κB通路促进肺腺癌细胞的侵袭,且FKBP4与Hsp90的相互结合有利于肺腺癌细胞的侵袭。结论FKBP4 通过整合 FKBP4/Hsp90/IKK 与 FKBP4/Hsp70/RelA 复合物,增强 NF-κB信号通路及其转录活性,从而促进肺腺癌的进展。