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研究表明R2R3-Myb转录因子在应答非生物和生物胁迫等方面起着重要作用,对其分离并进行Myb结构和功能的研究,对阐明植物适应或抵御逆境机制具有重要研究意义。在生物信息学分析的基础上,我们从葡萄公共表达谱芯片中筛选到一个受包括低温、干旱等胁迫因子诱导并且与STS合成酶共表达的R2R3-Myb基因家族成员Myb14,并进一步利用包括生物化学、生理学与分子生物学的手段鉴定了它在调控白藜芦醇合成与抗寒与抗旱反应方面的功能,取得的主要研究成果如下: 1、通过汇总包括干旱处理等20张葡萄表达谱芯片的结果,进行全基因组水平的共表达分析,我们发现了R2R3-Myb类转录因子VvMyb14与VvSTS的共表达相关性,该候选基因定位在细胞核内,为具有C末端转录激活活性的转录因子。同时,我们选取白藜芦醇含量差异极大的两个葡萄品种中Myb14的表达量存在显著差异且与果实中白藜芦醇的含量相一致;利用UV-C处理葡萄叶片发现,Myb14与STS呈现相同的表达模式;在葡萄叶片中进行的瞬时表达也证实Myb14的过量表达提高了STS的表达量。 2、利用序列比对找到Myb14的一个同源蛋白DcMYB1,它被报道能够与顺式作用元件Box-L5互作,同时,对葡萄基因组上的STS基因上的启动子区域进行比对发现,在具有完整启动子的31个STS的核心启动子区域,有29个含有Box-L5 motif,利用酵母单杂交的试验结果证实,在‘Z168’葡萄中克隆到的两个Myb14蛋白均能与STS核心启动子序列及Box-L5特异性的结合。 3、在拟南芥里面同时表达35S∷Myb14与STSpromoter∷GUS发现,过量表达的Myb14能够激活STS启动子驱动的GUS的表达。上述结果表明,MYB14可以作为转录激活因子,直接结合STS启动子区域的Box-L5元件,激活STS基因的表达,从而调控葡萄体内的白藜芦醇含量。 4、VvMyb14与VaMyb14均能响应低温、干旱与高盐处理,在抗寒性极强的种山葡萄与低抗寒性的‘玫瑰香’中,Myb14对逆境响应模式存在差异,VaMyb14的响应时间更短,上调倍数相对较高。 5、在拟南芥中过量表达VaMyb14,转基因株系的抗寒和抗旱能力较野生型显著增强,说明Myb14参与了植物非生物胁迫的适应反应。 6、测定抗逆相关的生理指标发现,过量表达VaMyb14的不同拟南芥中的抗氧化酶SOD、POD、CAT活性增强,同时降低膜脂过氧化程度。 7、酵母双杂交的结果显示,VaMyb14蛋白能够与AtICE1蛋白互作,由于AtICE1是AtDREB1/CBF的正调控因子,CBF1/2/3在转基因拟南芥中的上调表达,可能与此有关,同时CBF基因的上调表达部分地解释了转基因拟南芥抗寒性和抗旱性的增强。 8、基因芯片的结果显示,一系列与ABA代谢与信号转导相关的基因在转基因拟南芥中被上调表达,包括3个PP2C、CBF1/2/3以及结构基因RD29B、COR78、LTP3、LTP4等,表明VaMyb14除了在ABA信号转导途径的下游与ICE1互作外,还激活了ABA信号转导途径中的上游基因。