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1.背景和目的急性肺损伤（Acute lung injury,ALI）或急性呼吸窘迫综合征（Acute respiratory distress syndrome,ARDS）是指由严重感染、创伤等各种心源性以外的致病因素所引起的临床危重病症之一,临床表现为急性呼吸窘迫、顽固性低氧血症和非心源性肺水肿。ALI/ARDS发病因素复杂,临床上多种肺部（例如:肺炎,胃食管反流、淹溺等）或非肺部（例如:严重脓毒症,创伤,大量输血等）疾病均可致病。ALI/ARDS临床发病率高、病情进展迅速,死亡率居高不下。虽然近年来在气道管理和保护性机械通气策略等方面取得了一定的进展,仍缺乏有效的药物治疗手段,探寻ALI/ARDS发病机制中的关键药物治疗靶点依旧是目前呼吸与危重症医学科研究的热点。ALI/ARDS的发病机制尚未完全阐明,研究认为ALI/ARDS是一种失控和级联放大的炎症反应,其显著的病理特征为肺泡上皮细胞及肺毛细血管内皮细胞弥漫性损伤。氧化应激和炎症反应在其发病进程中扮演重要的角色,大量活性氧自由基（Reactive oxygen species,ROS）直接损伤肺组织,造成肺实质细胞的氧化损伤及肺间质组织水肿,致病情加重。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,NADPH oxidase）是肺泡上皮细胞产生ROS的主要酶,细胞内ROS兼具细胞防御和作为第二信使介导信号通路的功能,在肺部炎症反应和缺血/再灌注损伤等病理生理过程中发挥关键作用。研究证实脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）通过激活NADPH氧化酶产生ROS引起的氧化应激是ALI/ARDS肺组织炎症反应进展的重要事件。因此,深入研究LPS诱导炎症损伤的具体发病机制对临床治疗ALI/ARDS具有重要的指导意义。聚合酶δ相互作用蛋白2（Polymerase delta-interacting protein 2,Poldip2）是一种多功能蛋白,先前研究表明其作为一种重要的辅助因子,可与人类DNA聚合酶δp50亚基和增殖细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen,PCNA）相互作用。Poldip2可在人体肺脏、肾脏及大脑等组织中广泛表达,参与细胞DNA复制和损伤修复、线粒体功能和延伸以及细胞外基质调节等。此外,有研究表明Poldip2在血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells,VSMCs）中可作为NADPH氧化酶4（NADPH oxidase 4,Nox4）的伴侣蛋白,参与调节Nox4蛋白表达和活性水平。本课题组前期预实验结果表明气道雾化LPS可显著上调C57BL/6小鼠肺组织中Poldip2蛋白的表达,然而,Poldip2是否参与LPS诱导的ARDS以及具体分子机制目前尚不清楚。本课题通过构建携带靶向小鼠肺组织Poldip2基因的腺相关病毒载体,转染含Poldip2基因的短发夹RNA（sh RNA）下调小鼠肺组织Poldip2表达,探讨Poldip2在LPS诱导的小鼠ARDS中的作用。通过重组含Poldip2基因的慢病毒过表达或敲低载体转染人肺泡上皮细胞上调或下调Poldip2的表达,研究其下游信号通路中相关蛋白及炎症因子水平的变化,阐明Poldip2调控LPS刺激人肺泡上皮细胞氧化应激和炎症反应的机制,为临床治疗ARDS提供新的思路。2.研究方法第一部分:研究一:气道内雾化LPS成功诱导ARDS小鼠模型。方法:1.首先选择C57BL/6小鼠构建LPS诱导ARDS模型。选取24只C57BL/6健康雄性小鼠,随机分为4组:气管内雾化生理盐水组、气管内雾化LPS组、腹腔注射生理盐水组和腹腔注射LPS组（每组6只）。正常对照组小鼠通过气管内雾化或腹腔注射等体积的无菌生理盐水,实验组小鼠分别经气管内雾化或腹腔注射LPS 5mg/kg构建ARDS模型,24 h后观察不同给药方式致小鼠肺组织的炎症损伤情况,选择最接近ARDS病理特点的小鼠模型。2.选取36只C57BL/6健康雄性小鼠,随机分为6组:气管内雾化LPS后不同时间点（0、3、6、12、24与48 h）组（每组6只）。按照LPS 5 mg/Kg的剂量气管内雾化,分别在处理后相应时间点处死小鼠,获取肺组织评估肺组织病理损伤、炎症因子水平和氧化应激指标的变化。结果:1.气管内雾化LPS组小鼠肺组织炎症损伤最为严重,更接近ARDS病理特点。2.气管内雾化LPS后,观察肺组织损伤病理评分、MDA含量以及BALF中TNF-a和IL-1β浓度在24 h达最高峰;而肺组织SOD活性在24 h达最低点。结论:1.成功构建气管内雾化LPS诱导的小鼠ARDS模型。2.气管内雾化LPS诱导小鼠ARDS模型的最佳剂量和时间分别为5 mg/Kg和24 h。研究二:Poldip2敲低降低氧化应激和炎症反应对LPS诱导的小鼠ARDS的作用及机制。方法:1.为明确Poldip2与ARDS的相关性,选取C57BL/6健康雄性小鼠36只,随机分为6组:气管内雾化LPS后不同时间点（0、3、6、12、24与48 h）组（每组6只）,气管内雾化LPS组分别于LPS刺激后相应时间点处死小鼠,获取并检测肺组织中Poldip2蛋白表达的变化。2.选取C57BL/6健康雄性小鼠12只,随机分为转染小鼠Poldip2基因的短发夹RNA（Poldip2sh RNA）组和阴性对照（NCsh RNA）组（每组6只）,通过小鼠气管内注射重组腺相关病毒6型（AAV-6）载体。正常饲养5周后处死小鼠,获取并检测肺组织中Poldip2蛋白表达的变化。3.为明确Poldip2在小鼠ARDS中的作用,选取气管内注射携带NCsh RNA或Poldip2-sh RNA序列的重组AAV6载体的C57BL/6健康雄性小鼠24只(6.5 x1010vg/小鼠,50μl),随机分为如下4组:阴性对照（NCsh RNA）组、阴性对照+LPS刺激（NCsh RNA+LPS）组、Poldip2基因敲低（Poldip2sh RNA）组和Poldip2基因敲低+LPS刺激（Poldip2sh RNA+LPS）组（每组6只）,观察Poldip2基因敲低对小鼠ARDS肺组织中氧化应激和炎症反应水平的影响,并探讨其调控机制。结果:1.与Control组相比,气管内雾化LPS组小鼠肺组织中Poldip2蛋白水平呈时间依赖性增加,24h达到最高峰。2.转染AAV-6载体携带的Poldip2sh RNA显著下调小鼠肺组织中Poldip2的表达。3.Poldip2基因敲低可显著抑制ARDS小鼠肺组织炎症反应。4.Poldip2基因敲低可显著降低ARDS小鼠BALF总蛋白浓度。5.Poldip2基因敲低可显著降低ARDS小鼠肺组织氧化应激水平。6.Poldip2基因敲低可显著下调ARDS小鼠肺组织中COX-2表达,上调HO-1表达。结论:1.成功构建特异性敲低肺组织Poldip2基因的小鼠模型。2.Poldip2基因敲低可显著抑制LPS诱导的ARDS小鼠肺组织中的氧化应激和炎症反应水平,表明下调Poldip2表达对LPS诱导的小鼠ARDS起保护作用。第二部分:Poldip2通过调控Nox4信号通路介导LPS刺激的人肺泡上皮细胞的作用机制。方法:1.肺泡上皮细胞氧化应激和炎症反应是LPS诱导ARDS时主要的病理变化。采用人肺腺癌细胞株A549细胞,用含不同浓度LPS（0、2.5、5、10、15、20和40μg/m L）的无血清培养基刺激A549细胞48 h,建立LPS刺激A549细胞损伤模型,MTT法检测细胞活性。2.为明确Poldip2与LPS刺激A549细胞损伤的相关性,将A549细胞随机分为正常对照组（Control）和LPS组,观察LPS刺激后不同时间点（0、3、6、12和24h）Poldip2蛋白表达的变化;免疫共沉淀（CO-IP）法验证Poldip2蛋白与细胞内产生ROS的Nox4蛋白的相互作用。3.为明确Poldip2在LPS刺激A549细胞损伤中的作用,分别通过转染携带sh RNA对照（sh Cont）和sh Poldip2敲低（sh Poldip2）干扰序列的慢病毒载体,继续培养72h后处理组予以10μg/m L LPS刺激,非处理组予以等量PBS刺激。实验分组:sh Cont组、sh Cont+LPS组、sh Poldip2组和sh Poldip2+LPS组,探讨Poldip2敲低对LPS刺激A549细胞后氧化应激和炎症水平的影响及其机制。4.为进一步明确Poldip2在LPS刺激A549细胞损伤的作用,分别通过转染携带过表达对照（Lv Cont）和Poldip2过表达（Lv Poldip2）序列的慢病毒载体,继续培养72 h后处理组予以10μg/m L LPS刺激,非处理组予以等量PBS刺激。实验分组:Lv Cont组、Lv Cont+LPS组、Lv Poldip2组和Lv Poldip2+LPS组,探讨Poldip2过表达对LPS刺激A549细胞时氧化应激和炎症水平的影响及其机制。5.为进一步明确LPS刺激A549细胞损伤时Nox4参与调控Poldip2的下游信号通路。分别通过脂质体转染si RNA对照（si Cont）和si Nox4敲低（si Nox4）到A549细胞内,继续培养72 h后处理组予以10μg/m L LPS刺激,非处理组予以等量PBS刺激。实验分组:si Cont组、si Cont+LPS组、si Nox4组和si Nox4+LPS组,探讨Nox4敲低对LPS刺激A549细胞时氧化应激和炎症水平的影响及其机制。结果:1.LPS刺激A549细胞12 h后可引起氧化应激和炎症反应。2.LPS刺激A549细胞后Poldip2蛋白表达呈剂量/时间依赖性增加。3.Poldip2敲低显著减弱LPS诱导的氧化应激和炎症反应。4.Poldip2过表达显著增强LPS诱导的氧化应激和炎症反应。5.LPS诱导A549细胞中Poldip2和Nox4蛋白相互作用。6.Nox4敲低明显减弱LPS诱导的氧化应激和炎症反应,但对Poldip2的表达无影响。结论:1.Poldip2作为Nox4蛋白的上游调节蛋白,二者间存在蛋白相互作用。2.Poldip2敲低和过表达可分别通过下调或上调Nox4蛋白表达、NADPH氧化酶活性以及下游信号通路,参与调控LPS刺激A549细胞中氧化应激和炎症反应。