论文部分内容阅读
研究背景:血管内皮屏障破坏是脓毒症肺损伤的重要特征,血管内皮损伤会导致组织水肿、炎症细胞浸润、加重炎症因子释放。探究血管内皮损伤的发生机制,发现其治疗靶点一直倍受关注。Moesin蛋白是一种细胞膜和细胞骨架的相连蛋白,在血管内皮细胞中高表达,主要参与内皮细胞骨架维持、细胞内外信号转导,对血管内皮功能至关重要。然而,Moesin蛋白调控血管内皮细胞通透性的机制尚不十分清楚,Moesin蛋白对血管内皮细胞炎症反应的调节作用也不清楚。因此,本文第一、二章将分别探讨Moesin蛋白在脓毒症患者及脓毒症小鼠模型中的变化及意义,第三章将构建内毒素内皮细胞损伤模型,探讨Moesin蛋白对脓毒症内皮细胞损伤的调控作用及其相关机制;第四章运用慢病毒敲降Moesin蛋白,探讨Moesin蛋白敲降对脓毒症小鼠的保护作用及机制。目的:观察脓毒症患者血清Moesin蛋白的变化情况,探讨Moesin和脓毒症严重程度的相关性。探讨Moesin蛋白在脓毒症小鼠模型中的表达情况,以及Moesin蛋白与脓毒症肺损伤的关系。在细胞模型中进一步研究Moesin对ROCK1/MLC轴、NF-κB信号通路的调控作用,以期明确Moesin蛋白参与调控血管内皮细胞通透性以及炎症反应的分子机制。在脓毒症小鼠模型中敲降Moesin蛋白,观察敲降Moesin蛋白对脓毒症小鼠的保护作用。方法:1、纳入正常对照组24例、脓毒症组20例、脓毒症休克组23例,收集目标人群的血液标本,并收集脓毒症患者SOFA评分、APACHE Ⅱ评分、血清降钙素原（PCT）、C-反应蛋白（CRP）、白细胞计数（WBC）等相关临床资料,采用ELISA检测目标人群的血清Moesin蛋白含量,进行相关性分析;SPSS 22软件用于统计分析。2、应用致死性、非致死性盲肠结扎穿孔（CLP）,以及不同剂量的LPS腹腔注射进行造模,以模拟脓毒症、以及脓毒症休克,其中CLP造模分为分为对照组、盲肠结扎单次穿孔（CLP组）、盲肠结扎2次穿孔（2CLP组）,每组小鼠20只;LPS造模分为对照组、低剂量组（3mg/kg/d）、高剂量组（6mg/kg/d）,每组小鼠20只;实验结束后,收集不同组别小鼠的血液,检测血清Moesin蛋白、PCT,留取小鼠肺脏、肺泡灌洗液（BALF）等样本,进行病理、肺湿/干比、BALF蛋白含量等检测,并进行相关性分析;3、体外培养HMEC-1细胞、MLE-12细胞、RAW264.7细胞,利用si-RNA敲弱Moesin蛋白表达,给予细胞不同浓度、不同时间的脂多糖（LPS）刺激,观察Moesin蛋白敲降对血管内皮细胞、肺泡上皮细胞的单层细胞通透性的影响,以及对HMEC-1细胞炎症因子表达的影响;Western Blot法检测各组HMEC-1细胞ROCK1/MLC、NF-κB信号通路蛋白表达量,免疫荧光法检测各组HMEC-1细胞NF-κB信号通路相关蛋白表达;ELISA法检测各组HMEC-1细胞培养上清TNF-α、IL-6、IL-18、IL-1β表达量;4、利用慢病毒气道滴注+尾静脉注射的方法敲降Moesin蛋白,CLP的方式构建脓毒症模型,小鼠随机分为对照组、CLP+sh-NC组,CLP+sh-MSN组,每组小鼠20只,实验结束后,收集小鼠肺脏、BALF等样本,进行病理、肺湿/干比、BALF蛋白含量等检测。Western Blot法检测各组小鼠肺脏ROCK1、NF-κB信号通路蛋白表达量,RT-PCR法检测各组小鼠肺脏TNF-α、IL-6、IL-18、IL-1β的mRNA表达量。结果:1、脓毒症休克组（1974.57±838.15 pg/ml）及脓毒症组（1038.55±477.19pg/ml）血清Moesin蛋白较正常对照组（726.67±64.28 pg/ml）明显增高,差异有统计学意义（P＜0.01）;相关性分析结果提示脓毒症组血清Moesin与SOFA（r=0.4918,P=0.0008）、APACHE Ⅱ评分（r=0.3556,P=0.0193）呈正相关;相关性分析结果提示血清Moesin与PCT（r=0.3455,P=0.0232）呈正相关,与CRP（r=0.08642,P=0.6216）,WBC（r=0.2409,P=0.05801）无明显相关性;2、LPS腹腔注射造成了小鼠明显肺组织病理损伤,增加小鼠肺组织的含水量,以及BALF蛋白含量,LPS组血清Moesin蛋白含量、PCT也有明显的增加趋势,其中高剂量LPS组的上升趋势更加明显,相关性分析显示血清Moesin蛋白与血清PCT、小鼠肺脏病理损伤评分以及肺W/D比呈正相关;CLP造模也得到了类似的实验结果,CLP手术造成了明显肺组织病理损伤,增加小鼠肺组织的含水量,CLP小鼠血清Moesin蛋白含量也明显增高,相关性分析显示血清Moesin蛋白与小鼠肺脏病理损伤评分以及肺W/D比呈正相关;3、LPS刺激HMEC-1细胞,会导致HMEC-1细胞Moesin蛋白磷酸化明显增加,HMEC-1细胞通透性也明显增加,二者均呈时间、浓度依赖性;敲弱Moesin蛋白后,再给与相应的LPS刺激,HMEC-1细胞通透性的上升趋势明显受到抑制;LPS刺激MLE-12细胞后,细胞通透性、及Moesin蛋白磷酸化也有所增加,但没有时间、浓度依赖性;LPS刺激会导致HMEC-1细胞高表达ROCK1,肌球蛋白轻链（MLC）磷酸化明显增加,而Moesin蛋白敲弱减轻ROCK1/p-MLC的上升趋势;LPS刺激HMEC-1细胞,增加了 NF-κB的磷酸化,导致HMEC-1细胞炎症因子的释放增加,敲弱Moesin蛋白,下调了 NF-κB的磷酸化水平,也减轻了 HMEC-1细胞炎症因子的表达。4、慢病毒气道滴注+尾静脉注射的方法有效敲降了小鼠肺脏Moesin蛋白,Moesin蛋白敲降减轻了CLP手术造成的小鼠肺脏损伤,降低了小鼠肺W/D比,以及BALF蛋白含量;Moesin蛋白敲降下调了小鼠肺脏ROCK1、NF-κB蛋白表达,减轻了小鼠肺脏的炎症反应。结论:1、脓毒症患者血清Moesin水平明显增高,并与患者疾病严重程度正相关;2、脓毒症小鼠血清Moesin水平明显增高,并与小鼠肺脏损伤的严重程度正相关,可以作为脓毒症肺损伤的一个预测指标;3、敲弱Moesin蛋白可以明显减轻LPS造成的内皮细胞高通透性及炎症因子表达,其作用机制可能是通过调控ROCK1/MLC轴,以及NF-κB信号通路实现的;4、敲降Moesin蛋白可以明显减轻CLP手术造成小鼠肺脏病理损伤,以及炎症反应,Moesin蛋白可能作为脓毒症肺损伤的一个新的治疗靶点。