研究目的：通过建立COPD小鼠模型,检测益气化痰方对不同组别小鼠血浆、BALF和肺组织中TNF-α、IL-17、Muc5ac的表达水平,探讨益气化痰方对小鼠肺组织MAPK和NF-κB信号转导通路活化的影响及Muc5ac和AQP5 mRNA的基因表达影响,研究益气化痰方对气道炎症、黏液分泌调节作用的机制。从分子生物学层面阐释中医学理论“肺主气-益气”,“肺主通调水道-化痰”以及益气、化痰治则的内在关系,从而为COPD中医治疗提供实验依据和参考。研究方法：1.选用健康雄性C57BL小鼠60只,随机数字法分成6组：分别是正常对照组,COPD模型组,低剂量中药组,中剂量中药组,高剂量中药组,地塞米松组。每组10只。采用香烟烟熏方法建立慢性阻塞性肺疾病小鼠模型,从小鼠一般情况、肺组织病理形态学(肺组织肉眼观察、HE染色病理切片)观察以及BALF细胞组成及细胞总数三个指标评价慢性阻塞性肺病小鼠模型以及益气化痰方对慢性阻塞性肺病小鼠炎症细胞水平和病理改变的影响；2.采用WBP全身体积记录仪在造模的第20周对各组小鼠进行无创肺功能检查,记录PIF、PEF和MV。了解动物模型的气道阻力和肺顺应性情况,探讨实验动物模型的可靠性。3.采用免疫组织化学方法检测模型小鼠肺组织内TNF-α、IL-17、Muc5ac的表达。比较分析益气化痰方对肺组织内细胞因子的表达的影响,研究益气化痰中药对COPD小鼠的治疗作用。4.应用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测模型小鼠血浆和BALF中TNF-α、IL-17含量和BALF中Muc5ac含量。探讨益气化痰方对模型小鼠抗炎、抑制黏蛋白分泌的作用机制。5.应用RT-PCR方法检测模型小鼠肺组织Muc5ac和AQP5 mRNA的基因表达情况。分析益气化痰方对其表达水平的影响,从炎症／免疫反应介质角度评价不同剂量组的药效及其作用靶点。6.采用Western blot方法检测肺组织p38-MARK、Erk、JNK和NF-κB磷酸化的蛋白含量。分析益气化痰方对COPD小鼠肺组织MAPK和NF-κB信号通路的影响,进一步证明益气化痰方是通过IL-17/MAPK. NF-κB信号通路调控气道炎症反应,改变气道上皮Muc5ac mRNA和AQP5表达。7.实验数据用x±s表示,采用SPSS16.0统计软件包进行统计分析。不同组间采用one-way ANOVA进行方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义,以P<0.01为显著性统计学意义。研究结果：1.益气化痰方对COPD小鼠各指标的影响1.1组织形态学观察HE染色后镜下观察,结果显示：正常对照组小鼠的肺组织内,支气管粘膜上皮及肺泡结构完整,支气管管腔内纤毛排列整齐,未见有明显的分泌物,管壁未见增厚,粘膜下层未见有明显的炎症细胞浸润,肺泡腔未见有明显的扩张。模型组小鼠的肺组织内,支气管上皮细胞排列紊乱,柱状上皮细胞脱落严重,杯状细胞数量增多,纤毛少量倒伏脱落,不整齐排列,支气管管壁增厚,管腔变形狭窄,粘膜下腺体明显增生,伴有大量的炎症细胞浸润,以中性粒细胞、单核巨噬细胞和淋巴细胞为主。肺泡壁变薄或断裂,肺泡腔增大,部分融合成肺大疱,导致肺泡的数量明显减少,肺间质和肺泡腔内可见大量的炎症细胞浸润。1.2肺组织切片观察PAS染色可以将肺组织中粘液染成紫红色。正常对照组小鼠肺内支气管内粘液较少,PAS染色阳性细胞的比例也比较低,而模型组小鼠肺组织内支气管内粘液明显增多,PAS染色细胞的数量也明显增多。1.3肺功能指标改变采用WBP全身体积记录仪在造模的第20周对各组小鼠进行无创的肺功能检查。结果发现,与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠PIF、PEF和MV数值显著下降(P<0.01),符合COPD的临床肺功能特点。高、中、低剂量的益气化痰方均能明显改善COPD小鼠气道的高反应状态(P<0.05),改善作用同剂量呈现一定的依赖关系,高剂量的益气化痰方改善作用最强,但各项指标数据仍低于正常对照组小鼠,中剂量的益气化痰方的改善作用次之,低剂量益气化痰方的改善作用较弱,而地塞米松组气道阻力没有明显的改善作用(P>0.05)。1.4 BALF细胞组成及细胞总数的变化研究显示COPD模型组的总白细胞计数值最高,与正常组相比有显著性差异(P>0.05),益气化痰中药高、中、低剂量组与模型组比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01),说明益气化痰中药对COPD大鼠炎症细胞有明显的抑制效果；在细胞分类计数中,各组均以单核巨噬细胞为主,与正常对照组比较,模型组单核巨噬细胞百分比显著降低(P<0.01),而淋巴细胞、中性粒细胞百分比均显著增加(P<0.01),与模型组比较,益气化痰中药高、中、低剂量组单核巨噬细胞显著增加(P<0.01或P<0.05),淋巴细胞、中性粒细胞、百分比显著降低(P<0.01或P<0.05),提示香烟烟雾造模能诱导小鼠单核巨噬细胞百分比降低、淋巴细胞、中性粒细胞百分比升高,而益气化痰方能明显地升高COPD小鼠的单核巨噬细胞百分比,降低淋巴细胞、中性粒细胞的百分比,对COPD小鼠炎症细胞的抑制分泌作用明显；不同剂量益气化痰中药对实验小鼠炎症细胞的影响具有明显的量效关系。高、中、低剂量益气化痰方对IL-17介导的炎症反应有抑制作用,其中地塞米松组BALF中的炎症细胞数量明显减少,高剂量中药组次之,紧接着是中剂量组,低剂量组小鼠BALF中的炎症细胞数量减少最不明显。2.益气化痰方对实验小鼠TNF-α、IL-17, Muc5ac表达的影响2.1 COPD小鼠肺组织内TNF-α、IL-17, Muc5ac的表达的变化免疫组化检测结果显示,IL-17、TNF-α、Muc5ac在正常小鼠肺组织呈弱阳性表达。而在COPD模型组小鼠肺组织内,IL-17、TNF-α、Muc5ac呈强阳性表达。提示IL-17可协同活化的巨噬细胞产生TNF-α,促进TNF-α诱导的多种中性粒细胞趋化,放大炎症反应,使粘液分泌增加。激素可以阻断或者抑制这种炎症趋化因子表达,实验也证明地塞米松也能明显降低COPD小鼠肺组织内TNF-α和IL-17的表达。2.2 COPD小鼠血浆和BALF中TNF-α、Il-17含量的变化ELISA结果显示,正常小鼠血浆和BALF与COPD模型组中血浆和BALF相比TNF-α的含量有显著统计学差异(P<0.01)；正常小鼠血浆和BALF与COPD模型通过IL-17募集中性粒细胞分泌炎性介质,诱导产生的各种趋化因子,使炎症细胞到达靶部位。与COPD小鼠模型组比较,益气化痰中药高、中、低剂量组血浆和BALF中TNF-α和IL-17的含量逐渐降低,差异明显(P<0.01)。对照药物地塞米松组与模型组相比则能明显降低COPD小鼠血浆和BALF中TNF-α和IL-17的含量(P<0.01)。提示益气化痰方可以降低气道炎症反应,其机制可能与Th17/IL-17介导COPD的慢性炎症及免疫保护应答相关。2.3 COPD小鼠BALF中Muc5ac含量的变化ELISA结果显示,正常组小鼠BALF中Muc5ac的含量OD值低于模型组,提示实验动物模型在炎症因子作用下上调Muc5ac的表达。益气化痰方高、中、低剂量BALF中Muc5ac含量逐渐降低,但低剂量组BALF中Muc5ac含量与COPD模型组无明显统计学差异(P>0.05),中、高剂量组和地塞米松组BALF中Muc5ac含量与COPD模型组有统计学意义差异(P<0.05),提示益气化痰方通过抑制小鼠肺组织Muc5ac分泌,改善COPD气道重构。2.4 COPD小鼠肺组织Muc5ac和AQP5 mRNA水平的变化RT-PCR结果显示,同正常小鼠相比,模型组小鼠Muc5ac mRNA水平显著升高(P<0.01),而AQP5 mRNA转录水平则显著下调(P<0.01)。提示实验小鼠肺组织Muc5ac mRNA表达亢进,AQP5 mRNA表达抑制,两者呈负相关；益气化痰方高、中、低剂量均能明显下调模型小鼠肺组织Muc5ac mRNA水平,上调AQP5 mRNA水平,其中高、中剂量组Muc5ac和AQP5 mRNA表达水平与模型组有显著差异(P<0.01),低剂量组下调Muc5ac mRNA表达水平与模型组有明显差异(P<0.05)。提示高剂量组益气化痰方对COPD小鼠肺组织Muc5ac、AQP5 mRNA转录水平优于低剂量组,且各剂量组对Muc5ac和AQP5 mRNA的表达呈量效依赖关系。2.5 COPD小鼠肺组织Muc5ac和AQP5 mRNA蛋白水平的变化Western blot结果显示,与正常组比较,COPD模型组小鼠Muc5ac mRNA水平显著升高(P<0.01),而AQP5 mRNA水平则显著降低(P<0.01)。表明益气化痰方可升高COPD小鼠肺组织Muc5ac mRNA蛋白水平,抑制AQP5 mRNA蛋白水平；益气化痰方高、中1、低剂量COPD小鼠肺组织中Muc5ac mRNA蛋白条带印记颜色均变浅,表达强度显著减弱(P<0.01), AQP5mRNA条带印记颜色均加深,表达强度显著增强(P<0.01或P<0.05),其中高、中、低剂量组Muc5ac和AQP5 mRNA表达水平与模型组有显著差异(P<0.01),实验显示高剂量益气化痰方和地塞米松组上调COPD小鼠肺组织Muc5ac mRNA蛋白水平,下调AQP5 mRNA水平的效能优于低剂量组,且各剂量组对Muc5ac和AQP5 mRNA蛋白的表达水平呈量效依赖关系。3.益气化痰方对COPD小鼠肺组织MAPK和NF-κB信号通路的影响3.1 COPD小鼠肺组织MAPK通路的变化Western blot结果显示,与COPD正常组比较,模型组小鼠肺组织内Erk、P38和JNK蛋白水平显和磷酸化的蛋白分子的比例显著增高,而正常组小鼠肺组织蛋白含量和磷酸化处于较低水平；提示在COPD模型组小鼠肺组织内,MAPK信号通路可被明显激活；益气化痰方高、中、低组均能抑制COPD小鼠肺内MAPK信号通路的活化,其中高剂量的中药抑制作用最强,中剂量组次之,低剂量组的作用较弱。阳性对照药物-地塞米松则明显抑制COPD小鼠肺内MAPK信号通路的活化。3.2 COPD小鼠肺组织NF-κB信号通路的变化Western blot结果显示：与正常组比较COPD小鼠肺组织胞浆内IkappaB含量很高,NF-κB信号通路处于活化状态,提示COPD模型组小鼠肺组织内,NF-kappa B在下游信号通路发挥调控作用；益气化痰方高、中、低剂量组均能明显抑制COPD小鼠肺内NF-kappa B信号通路的活化。研究结论：1.COPD模型小鼠肺组织存在CD4+T/Th17细胞介导的IL-17细胞因子高表达,并通过其效应因子IL-17刺激TNF-α及其他炎症因子,增强Muc5ac表达水平,促使气道粘液分泌增多,并发生气道阻塞及重塑。2.益气化痰方能够降低COPD小鼠肺组织、血浆和BALF的IL-17、TNF-α等炎症细胞含量,减低Muc5ac含量,改善模型小鼠肺组织病理损害;益气化痰中药能明显地升高COPD小鼠的单核巨噬细胞百分比,降低淋巴细胞、中性粒细胞的百分比,对COPD小鼠炎症细胞分泌具有抑制作用。3.益气化痰方可以降低COPD小鼠肺通气功能PIF、PEF和MV数值,明显改善COPD小鼠气道的高反应状态。但各项指标数据不高于正常对照组。4.益气化痰方可以上调COPD小鼠肺组织Muc5ac mRNA蛋白转录水平,下调AQP5 mRNA转录水平,改善气道黏液高分泌状态。5.益气化痰方通过抑制COPD小鼠肺内MAPK和NF-κB信号转导通路的活化,发挥对COPD小鼠气道炎症因子、粘液高分泌的调节作用,这两个通路在调节IL-17受体信号转导中起着关键作用。因此,从免疫保护及炎症互相作用方面(IL-17,TNF-α→MAPK和NF-κB信号转导通路→ Muc5ac、AQP5 mRNA),来阐释益气化痰方治疗COPD的作用机制。6.益气化痰方不同剂量对实验大鼠炎症细胞、肺泡灌洗液中细胞因子、组织Muc5ac蛋白、APQ5 mRNA表达及MAPK、NF-κB信号转导通路的影响存在量效依赖关系。