广西HIV-1实时荧光定量PCR方法的建立及其初步评价

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目的建立简便、实用、适宜于广西HIV-1流行毒株的实时荧光定量PCR方法,并对方法科学性进行评价。方法1、探针引物设计从美国Los Alamos国家实验室网站下载以广西为代表的国内主要HIV-1流行毒株,采用Clustalx和BioEdit软件进行比对,获取HIV-1序列的保守区域序列。再利用Primer ExPress软件设计实时荧光定量PCR引物和TaqMan探针。2、标准品构建采用RT-PCR的方法对广西HIV-1感染者的病毒RNA进行扩增,扩增产物回收纯化后与pMD18-T Vector连接成重组质粒,转化到大肠杆菌JM 109中,联合应用蓝白筛选、酶切、基因序列分析方法鉴定重组质粒。根据重组质粒的OD值换算出重组质粒的拷贝数,梯度稀释后作为实时荧光定量PCR的标准品。3、方法学评价应用设计的探针和引物初步建立实时荧光定量PCR检测方法,调整并优化该反应体系。建立荧光定量PCR的标准曲线,评价该方法的检测线性范围和检测下限、特异性、重复性等指标。4、国际标准方法比较运用建立的荧光定量PCR方法和NASBA病毒载量检测方法对56例HIV-1感染者的病毒载量进行检测,检验两种方法在检测率和病毒载量等级差异,考察两种方法的一致性和相关性。5、亚型适宜性评价把56份样本按照不同亚型归类,根据样本的病毒载量检测结果,分析荧光定量PCR方法对不同亚型的检测效果。6、国际参考品评价运用实时荧光定量PCR方法对15例国际参考品进行双盲检测,评价该方法对不同亚型和不同浓度样本检测的准确性和适用性。7、国内标准方法比较采用匹基公司的HIV核酸定量检测试剂盒和本研究建立的方法同时对72例现场收集的HIV-1感染者标本进行检测,并进行比较,初步了解该方法与国内试剂盒检测结果的一致性和相关性。结果1、探针引物设计设计出适宜扩增广西HIV-1流行毒株的TaqMan探针引物。2、标准品构建成功构建了包含广西HIV-1毒株序列的重组质粒标准品,以10倍倍比稀释成不同浓度用于制作标准曲线。3、方法学评价建立的HIV-1荧光定量PCR方法的检测下限可达到150copies/mL,当HIV-1标准品含量在1.5×102-1.5×108拷贝范围内时,荧光定量PCR的标准曲线图显示Ct值与HIV标准品拷贝数的对数值之间具有良好的线性关系,相关系数r=0.9968,slope=-3.384;方法的特异度为100%,批内变异系数为0.977%、1.129%、1.415%、1.328%、0.528%、0.798%,批间变异系数为1.156%;试剂经反复冻融,还能达到较高的稳定性。4、国际标准方法比较荧光定量PCR方法与NASBA方法测得HIV-1病毒载量平均值分别为(4.411±0.673)log拷贝数/mL和(4.467±0.658)log拷贝数/mL,差异无统计学意义(t=1.207,P=0.233>0.05);两者在HIV RNA阳性率和病毒载量等级基本一致(P>0.05),两种方法检测结果的相关系数r=0.880(P<0.01),logNASBA拷贝数/mL值=0.671+0.861×log real-time PCR拷贝数/mL值。5、亚型适宜性评价荧光定量PCR方法能检出广西流行的B’、CRF01-AE、CRF07-BC、CRF08-BC亚型,并且各个亚型的阳性率基本一致。6、国际参考品评价经15个国际参考品检验,荧光定量PCR方法能检出高于103拷贝数的各个样本,但对于小于103拷贝数的样本,不能完全检出。7、国内标准方法比较本研究建立的real-time PCR方法及匹基公司的real-time PCR方法测得HIV-1病毒载量平均值分别为(4.393±0.690)log拷贝数/mL和(4.330±0.809)log拷贝数/mL,差异无统计学意义(t=-1.438,P=0.156>0.05);本研究建立的方法的HIV病毒载量检出率为84.7%(61/72),匹基公司方法为87.5%(63/72),两者的检出率和病毒载量等级差异均无统计学意义( P>0.05);两种方法检测的病毒载量的log值呈直线线性相关,即log匹基公司检测值= -0.388+1.074×log本研究检测值(相关系数r=0.917,P<0.001 );当检测103-105copies/mL数量级样本时,两种方法表现较好的一致(37/43),但在检测低于103拷贝数样本和高于105拷贝数样本时,变异增大。结论建立的荧光定量PCR方法具有线性范围广,特异度高,重复性好,检测下限低,检测试剂稳定性好,并与国际标准的NASBA法检测结果高度相关,与国内标准的试剂盒产品具有较好的一致性,能适应广西地区不同HIV-1亚型。因此,该方法实用、可行,在病毒载量检测、早期感染检测、治疗病人的耐药监测等方面具有良好的应用前景。
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